盧理英 彭瀟 張旭

癲癇是臨床常見的神經(jīng)功能異常疾病[1-2]，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前仍無有效治療手段。近年來，學(xué)者發(fā)現(xiàn)線粒體功能異常與癲癇發(fā)病密切相關(guān)[3]。親環(huán)蛋白D（CypD）是構(gòu)成線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的關(guān)鍵調(diào)節(jié)元件之一；在氧自由基或者Ca2+刺激下，通透性轉(zhuǎn)變孔持續(xù)開放，導(dǎo)致線粒體腫脹、細(xì)胞色素C（Cyt-C）釋放，引起含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）的級聯(lián)活化，最終由Caspase-3啟動凋亡[4-5]。本研究通過氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射方法構(gòu)建大鼠癲癇模型，檢測CypD在癲癇模型大鼠海馬組織中的表達(dá)，探討其意義，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 凋亡試劑盒（C1086）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）（A001-3）、過氧化氫酶（CAT）（A007-2）和丙二醛（MDA）（A003-1）試劑盒購于南京建成生物工程研究所，AccuPowerGreenstarTMqPCR PreMix試劑盒（K-6200）購于韓國Bioneer公司，CypD（43603）、Cyt-C（4280）、Caspase-3（9662）、β-Actin（3700）單克隆抗體購于美國 Cell Signaling Technology公司。

1.2 動物分組和處理 50只6～8周齡雄性SD大鼠[動物使用許可證號：SCXK（浙）2015-0009，體質(zhì)量（200±20）g]由溫州醫(yī)科大實(shí)驗動物中心提供。用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射40只6～8周齡的SD大鼠建立癲癇模型，最終取20只癲癇發(fā)作級別達(dá)Ⅳ級以上的大鼠納入實(shí)驗。將癲癇發(fā)作的SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為癲癇組和CypD抑制劑環(huán)孢素A（CsA）處理組（CsA組），每組10只。另取10只SD大鼠作為對照組。CsA組腹腔注射6mg/kg CsA，癲癇組和對照組分別腹腔注射等量的0.9%氯化鈉注射液。采用斷頭法處死各組SD大鼠，用剪刀撥開大鼠腦殼，分離腦組織，去除小腦，沿中線切開大腦，獲取海馬組織，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.3 癲癇模型的構(gòu)建 40只SD大鼠腹腔內(nèi)注射127mg/kg氯化鋰18h后，注射硫酸阿托品（1mg/kg）降低毒副反應(yīng)，再腹腔注射30mg/kg匹羅卡品，若首次注射匹羅卡品30min后，未出現(xiàn)癲癇癥狀者，可重復(fù)腹腔注射30mg/kg匹羅卡品，總數(shù)不超過3次。按Racine評分[6]評價每只大鼠癲癇發(fā)作等級，癲癇發(fā)作90min后給予地西泮（10mg/kg）終止。

1.4 CypD mRNA的相對表達(dá)量 檢測采用PCR法。取3組大鼠海馬組織分別加入Trizol液，提取總RNA，并合成cDNA。按照AccuPowerGreenstarTMqPCR Pre-Mix試劑盒說明書方法，配置20μl的總反應(yīng)體系，包括：cDNA 1μl、正負(fù)鏈引物 0.8μl，qPCR PreMix 10μl，0.9%氯化鈉注射液7.4μl，在適當(dāng)條件下，進(jìn)行PCR后，使用2-ΔΔCT法分析CypD mRNA表達(dá)情況。CypD引物序列：（正義鏈：ACACCAATGGCTCTCAGTTC，負(fù)義鏈：AGTGGCCTTCCTCATACTCA），GAPDH 引物序列：（正義鏈：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，負(fù)義鏈：GAAGATGGTGATGGGATTTC）。

1.5 CypD、Caspase-3、Cyt-C蛋白相對表達(dá)量 檢測采用Western blot法，將海馬組織制成勻漿后，冰上加入細(xì)胞裂解液裂解，低溫離心后，吸取上清液。按Bradford蛋白濃度測定方法作蛋白定量，取20μg總蛋白8%～12%聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，將膜置入含有5%脫脂牛奶的TBST溶液，室溫下封閉1h。按一定稀釋比例加入一抗，4℃過夜，用TBST洗膜8 min×3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1～2h，再次用TBST洗膜8min×3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液發(fā)光、顯影和定影。用Image J軟件進(jìn)行定量計算各個蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 海馬組織細(xì)胞凋亡數(shù) 檢測采用TUNEL染色法。取海馬組織常規(guī)脫蠟處理后，滴入20μg/ml的蛋白酶K，孵育15min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次；加入0.3%甲醇-過氧化氫溶液，孵育20min，再用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。按照每個樣品50μl，添加TUNEL檢測液，37℃避光孵育60min，滴加0.5ml終止液，洗滌3次；加入0.5ml顯色液進(jìn)行樣品顯色，光鏡下觀察細(xì)胞凋亡，并統(tǒng)計每個樣本單個視野下顯色陽性細(xì)胞數(shù)，取3個視野，求平均值。

1.7 檢測SOD、CAT和MDA含量 采用WST-1法檢測SOD含量、鉬酸銨法檢測CAT、TBA法檢測MDA含量。將海馬組織用0.9%氯化鈉注射液制成質(zhì)量體積比為1∶9勻漿，在4℃離心機(jī)中以4 000r/min離心10min，取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用ELISA方法檢測SOD、CAT和MDA含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠CypD mRNA與蛋白、Cyt-C、Caspase-3相對表達(dá)量和細(xì)胞凋亡數(shù)比較 見表1。

由表1可見，3組大鼠CypD mRNA與蛋白相對表達(dá)量，海馬組織細(xì)胞凋亡數(shù)，Cyt-C、Caspase-3相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與對照組比較，癲癇組CypD mRNA與蛋白相對表達(dá)量，海馬組織細(xì)胞凋亡數(shù)，Cyt-C、Caspase-3相對表達(dá)量增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與癲癇組比較，CsA組CypD mRNA與蛋白相對表達(dá)量，海馬組織細(xì)胞凋亡數(shù)，Cyt-C、Caspase-3相對表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。CsA組CypD mRNA與蛋白相對表達(dá)量，海馬組織細(xì)胞凋亡數(shù)，Cyt-C、Caspase-3相對表達(dá)量與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。3組大鼠海馬組織 CypD、Cyt-C、Caspase-3 蛋白表達(dá)量電泳圖見圖1。

表1 3組大鼠CypD mRNA與蛋白、Cyt-C、Caspase-3相對表達(dá)量和細(xì)胞凋亡數(shù)比較

圖1 3組大鼠海馬組織CypD、Cyt-C、Caspase-3蛋白表達(dá)量電泳圖

2.23 組大鼠海馬組織SOD、CAT和MDA含量比較 見表2。

表2 3組大鼠海馬組織SOD、CAT和MDA含量比較

由表2可見，3組SOD、CAT和MDA含量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與對照組比較，癲癇組SOD、CAT含量降低，MDA含量增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與癲癇組比較，CsA組SOD、CAT含量增高，MDA含量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。CsA組SOD、CAT、MDA含量與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

CypD又稱cyclophilin 40，因與CSA靶向性結(jié)合而得名，主要分布于線粒體基質(zhì)中，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生與發(fā)展中扮演重要角色[4]。氧化應(yīng)激條件下，CypD介導(dǎo)氧自由基誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷[7]，降低CypD表達(dá)，減輕腦缺血再灌注損傷[8]。CypD也參與神經(jīng)退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ　⒍喟l(fā)性硬化等）發(fā)生過程[9-10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)CypD的作用有雙面性，有學(xué)者認(rèn)為CypD與海馬組織神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)有關(guān)，CypD基因敲除小鼠的記憶和學(xué)習(xí)能力明顯增強(qiáng)[11]。也有學(xué)者認(rèn)為CypD缺陷的小鼠學(xué)習(xí)、記憶及回避行為較正常小鼠更為完善[12]。因此，明確CypD在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生和發(fā)展中的作用，對尋找靶向性預(yù)防和治療藥物具有重要意義。

在鈣超載或者氧化應(yīng)激條件下，CypD與蛋白電壓依賴性陰離子通道、腺苷酸轉(zhuǎn)位子共同構(gòu)成的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔持續(xù)開放，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，從而啟動線粒體凋亡途徑[4]。線粒體凋亡途徑是癲癇誘發(fā)神經(jīng)損害的重要途徑之一，多種抗癲癇藥物通過調(diào)節(jié)線粒體功能發(fā)揮抗癲癇、鎮(zhèn)靜作用[13-14]。本研究結(jié)果顯示，在癲癇模型中，CypD表達(dá)量和mRNA水平較明顯增高，提示可能發(fā)生了線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放、線粒體損傷。

氯化鋰-匹羅卡品通過激活谷氨酸興奮通路，誘發(fā)癲癇發(fā)作和癲癇持續(xù)狀態(tài)，是研究海馬區(qū)域，尤其是CA1和CA3區(qū)細(xì)胞凋亡的常用模型。本研究TUNEL染色結(jié)果亦顯示癲癇組海馬組織內(nèi)腦細(xì)胞凋亡較對照顯著增高，該結(jié)果與文獻(xiàn)相似[15]。癲癇組Cyt-C釋放量和Caspase-3表達(dá)量明顯增高，提示了癲癇發(fā)病過程中，啟動了線粒體凋亡途徑。CSA靶向性抑制CypD后，CSA組Cyt-C釋放量和Caspase-3明顯下降，而細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯降低，說明了靶向性抑制CypD，可降低癲癇模型大鼠海馬組織線粒體凋亡途徑的啟動。另外，與對照組比較，CsA組SOD、CAT含量增高，MDA含量降低，提示CsA靶向性抑制CypD后，癲癇大鼠海馬組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平降低，說明CypD啟動線粒體凋亡途徑，可能與其調(diào)節(jié)的氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

綜上所述，在氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)的癲癇模型中，海馬組織CypD表達(dá)增加，啟動了線粒體凋亡途徑。但本研究僅以單一的CsA作為陽性對照，分析CypD在癲癇中的表達(dá)及其意義，仍需從基因水平上，甚至采用基因敲除小鼠的手段，進(jìn)一步分析CypD在癲癇中作用，從而為研究預(yù)防和治療癲癇的CypD靶向性藥物提供更充分的根據(jù)。