王琦 趙佳 陳大方 何曉巖 陳萍 劉慧 洪藝揚(yáng) 沈筱蕓

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是一種從茶葉中提取的水溶性單體，具有明顯的抗氧化、抗炎癥、抗纖維化和抗肝癌作用[1-4]。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）不僅是全肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中占比近30%的基質(zhì)細(xì)胞，也是肝臟中最主要的免疫細(xì)胞之一?；罨腍SC是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要場所，也是各種致纖維化因素作用的主要效應(yīng)靶細(xì)胞，參與肝組織纖維化過程；HSC還具有抗原提呈細(xì)胞的活性，參與免疫調(diào)節(jié)過程。正常情況下HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)[5]。當(dāng)肝臟有炎癥或受到機(jī)械刺激等損傷時(shí)，HSC被激活，其表型由靜止型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚?，并且?xì)胞膜表面表達(dá)活化標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）。鑒于活化的HSC在EGCG抗纖維化作用機(jī)制中所扮演的角色尚不明確，筆者初步研究了EGCG對體外培養(yǎng)的人肝星狀細(xì)胞株（LX-2）細(xì)胞的生長狀態(tài)及活化表型的影響。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 LX-2購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞室，實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)（RTCA）系統(tǒng)由杭州艾森生物有限公司提供；DMEM培養(yǎng)基、FBS、青霉素和鏈霉素雙抗購自美國CellMax公司；胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司；PBS購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；純度95%EGCG購自美國Sigma-Aldrich公司；α-SMA-Alexa Fluor 405流式抗體購自美國Life Technologies公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（AnnexinV-PE/7-AAD）購自美國BD PharmingenTM公司；活細(xì)胞/凋亡細(xì)胞/壞死細(xì)胞鑒別試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；CO2培養(yǎng)箱Heal Force HF90/HF240購自上海力申科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)Heraeus Multifuge X1R購自美國Thermo Fisher Scientific公司；普通倒置顯微鏡ZEISS primovert、熒光倒置顯微鏡ZEISS AXIO Observer A1購自德國Carl Zeiss Jena公司；流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀LSRFortessaTM購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將LX-2細(xì)胞置于含10%FBS和110g/L濃度丙酮酸鈉的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，放于5%CO2和37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每2～3d傳代1次，最多5次，顯微鏡下觀察細(xì)胞未發(fā)生形態(tài)學(xué)變化。

1.3 EGCG對LX-2細(xì)胞生長影響監(jiān)測 將LX-2細(xì)胞體外培養(yǎng)至對數(shù)生長期，經(jīng)胰酶消化后，采用完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，PBS洗滌、離心、重懸后作細(xì)胞計(jì)數(shù)。將LX-2細(xì)胞混懸液接種于RTCA系統(tǒng)的E-Plate 16孔板中（每孔總體積 150μl，含 8×103個(gè)細(xì)胞），放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中的RTCA S16上，啟動監(jiān)測系統(tǒng)，每5min記錄1次監(jiān)測結(jié)果。待細(xì)胞增長至對數(shù)生長期（約18 h）時(shí)暫停監(jiān)測，將E-Plate 16孔板取出，分別加入終濃度為0、25、50、75、100、125、150、175μmol/L 的 EGCG，并設(shè)重復(fù)孔。重新將E-Plate 16孔板放回培養(yǎng)箱中的RTCA S16上，每15min監(jiān)測1次細(xì)胞活力和增殖情況，持續(xù)監(jiān)測72h（總監(jiān)測時(shí)間可長達(dá)200h）。通過RTCA系統(tǒng)動力學(xué)變化反應(yīng)曲線反映各孔0～90h間LX-2細(xì)胞的生長狀況。監(jiān)測結(jié)果顯示為標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)（cell index，CI）。通過RTCA Data Analysis Software 1.0軟件分析上述不同濃度EGCG作用至72h的CI值，生成增殖曲線和斜率，其中，增殖曲線可以直觀反映不同濃度梯度的藥物在連續(xù)作用至最后檢測時(shí)間點(diǎn)時(shí)的細(xì)胞生長狀態(tài)，斜率可以間接反映某一時(shí)間段細(xì)胞的增殖速率，斜率越大，細(xì)胞增殖速度越快，斜率越小，細(xì)胞增殖速度越慢；隨著監(jiān)測時(shí)間延長，各組斜率逐漸減小接近0軸，說明細(xì)胞增殖速率逐漸減慢至不再增殖，斜率負(fù)值表示細(xì)胞不僅不再增殖，且發(fā)生了明顯的凋亡，呈負(fù)增長狀態(tài)。

1.4 LX-2細(xì)胞凋亡率檢測 取對數(shù)生長期LX-2細(xì)胞，將LX-2細(xì)胞混懸液接種于6孔板（每孔總體積2ml，含3×105個(gè)細(xì)胞），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱 6h后，加入終濃度為0、25、50μmol/L的EGCG，分別繼續(xù)培養(yǎng)48和72h后，胰酶消化，完全培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞至15ml離心管。用預(yù)冷的PBS洗滌2次，離心，棄上清液，1×Binding Buffer重懸細(xì)胞后調(diào)整成濃度為1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取100μl/管細(xì)胞懸液至5ml流式管，每管分別加入5μl AnnexinV-PE和5μl 7-AAD，充分混勻后室溫避光孵育15min，最后每管再加入400μl 1×Binding Buffer，充分混勻后在1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。每組做3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Flowjo 7.6流式專業(yè)分析軟件分析，設(shè)十字門四象限顯示各類細(xì)胞各自占總細(xì)胞的比率（%），分別為：活細(xì)胞率（Q4）、早期細(xì)胞凋亡率（Q3）、晚期細(xì)胞凋亡率（Q2）、壞死細(xì)胞率（Q1），其中細(xì)胞總凋亡率＝Q3+Q2。

1.5 α-SMA表達(dá)檢測 取對數(shù)生長期LX-2細(xì)胞，按1.4方法處理細(xì)胞后，收集細(xì)胞至15ml離心管，PBS洗滌1次，離心，棄上清液。每管加入4%多聚甲醛500μl于4℃中固定10min，PBS洗滌、離心、棄上清液，加入0.1%Triton X-100/PBS，室溫孵育15min，PBS洗滌、離心、棄上清液，再加入10%羊血清/PBS，室溫孵育1h，再次PBS洗滌、離心、棄上清液后取適量PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移至流式管，每管分別加入5μl流式抗體α-SMA-Alexsa Fluor 405室溫避光孵育30min，最后PBS洗滌、離心、棄上清液，每管加入200μlPBS重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測α-SMA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Flowjo 7.6流式專業(yè)分析軟件分析，采用熒光素Alexsa Fluor 405的平均熒光強(qiáng)度值來反映α-SMA的表達(dá)強(qiáng)弱程度。每組作3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察 采用吖啶橙/溴乙錠（AO/EB）染色法。AO能透過胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光；EB僅能透過胞膜受損的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，發(fā)出橘紅色熒光。凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)為染色增強(qiáng)，熒光更為明亮，均勻一致的圓狀或固縮狀、團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)；非凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征，兩者形態(tài)明顯不同。在熒光顯微鏡下觀察，可見4種細(xì)胞形態(tài)：活細(xì)胞，核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)；早期凋亡細(xì)胞，核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀；非凋亡的死亡細(xì)胞，核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)；晚期凋亡細(xì)胞，核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對LX-2細(xì)胞生長狀態(tài)的影響 加入EGCG后，LX-2細(xì)胞的增殖曲線整體下移，且呈藥物濃度依賴性梯度變化，其中增殖曲線中最早且最急劇的下降時(shí)間為加入EGCG 3h后，表明EGCG作用3h后的LX-2細(xì)胞的生長開始受抑制，見圖1。此外，EGCG作用時(shí)間越長，細(xì)胞增殖抑制作用越明顯，EGCG濃度越高，細(xì)胞增殖抑制作用越明顯，見圖2。

圖1 RTCA實(shí)時(shí)監(jiān)控不同濃度EGCG對LX-2細(xì)胞的生長狀態(tài)的影響

圖2 RTCA實(shí)時(shí)監(jiān)控不同濃度EGCG對LX-2細(xì)胞增殖速率的作用

2.2 不同濃度EGCG作用后LX-2細(xì)胞凋亡率比較 根據(jù)上述RTCA藥物細(xì)胞監(jiān)測結(jié)果，筆者選擇0、25、50μmol/L這3個(gè)濃度EGCG進(jìn)行后續(xù)研究，通過AnnexinV-PE/7-AAD雙染法標(biāo)記細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測不同濃度EGCG作用48和72h后LX-2細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，0、25、50μmol/L的EGCG作用48h后，細(xì)胞總凋亡率組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；而EGCG 作用 72h后，25μmol/L和 50μmol/L組的細(xì)胞總凋亡率與0μmol/L組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），50μmol/L組的細(xì)胞總凋亡率也明顯高于25μmol/L組（P＜0.01）；細(xì)胞總凋亡率的組間差異是由早期凋亡變化引起，晚期凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，EGCG可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的方式來抑制細(xì)胞增殖，見圖3。

2.3 EGCG作用后LX-2細(xì)胞α-SMA的表達(dá) 不同濃度 EGCG作用 48或 72h后，25μmol/L和 50μmol/L組的α-SMA平均熒光強(qiáng)度均明顯低于0μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），25μmol/L與 50μmol/L組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果說明，EGCG可以抑制LX-2細(xì)胞的活化標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)，且作用時(shí)間越久，抑制效果更明顯，見圖4。

圖3 不同濃度EGCG作用后LX-2細(xì)胞的流式細(xì)胞圖和凋亡率比較（a：干預(yù)48、72h后的流式細(xì)胞圖；b：不同濃度 EGCG作用48和72h后的LX-2細(xì)胞總凋亡率比較；c：不同濃度EGCG作用72h后的 Q2與 Q3比較；與 0μmol/L 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 25μmol/L組比較，△△P＜0.01，nsP ＞0.05）

圖4 流式檢測EGCG作用后LX-2細(xì)胞α-SMA的表達(dá)（與0μmol/L 組比較，**P＜0.01）

圖5 EGCG作用后熒光顯微鏡下所見（AO/EB染色，×50）

2.4 各組細(xì)胞凋亡形態(tài)比較 EGCG作用48h，與0μmol/L組比較，25、50μmol/L組的活細(xì)胞生長密度降低，橘紅色的凋亡細(xì)胞增多；EGCG作用72 h，與0μmol/L組比較，25、50μmol/L組活細(xì)胞生長密度更低，橘紅色的凋亡細(xì)胞明顯增多。說明EGCG濃度越高，作用時(shí)間越長，抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用越明顯，見圖5（插頁）。

3 討論

HSC是1種位于肝臟竇周間隙Disse腔內(nèi)的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，這種細(xì)胞呈星狀細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞中富含維生素A和脂質(zhì)小滴，其細(xì)胞突起與肝臟內(nèi)的自主神經(jīng)末梢相連，能將肝內(nèi)自主神經(jīng)沖動傳遞給肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。HSC有靜息和活化兩種狀態(tài)，正常情況下肝星狀細(xì)胞呈靜息狀態(tài)，在肝臟中主要參與維生素A的代謝、儲存脂肪、調(diào)節(jié)血管和肝竇血流。當(dāng)肝臟受到物理、化學(xué)及病毒感染生物因素的刺激時(shí)，處于靜息狀態(tài)的HSC就會被激活，胞體增大，胞突伸展，胞質(zhì)中脂滴消失，維生素A含量減少，發(fā)生增殖并轉(zhuǎn)變?yōu)椤凹〕衫w維細(xì)胞”[6]。自1876年Kupffer意外發(fā)現(xiàn)并命名為HSC以來，聚焦HSC的研究結(jié)果一致認(rèn)為，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的主要介質(zhì)，而持續(xù)活化的HSC是肝纖維化中ECM的主要來源?；罨腍SC能表達(dá)活化標(biāo)志物α-SMA、波形蛋白和結(jié)蛋白，并通過增生和分泌ECM參與肝纖維化的形成和肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建；同時(shí)通過自分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β、血小板衍生生長因子、內(nèi)皮素-1等細(xì)胞因子使自身活化持續(xù)進(jìn)行。此外，HSC還能促使肝竇內(nèi)皮細(xì)胞收縮使肝竇內(nèi)壓升高[7]。因此，抑制星狀細(xì)胞的活化和減少纖維化介質(zhì)ECM的分泌一直是抗纖維化治療的主要策略。

EGCG被認(rèn)為是綠茶多酚的主要的活性成分。EGCG是1種有效的抗氧化劑，因其在預(yù)防氧化應(yīng)激相關(guān)疾病（包括癌癥，心血管疾病和纖維化）中的作用而備受關(guān)注[8-10]。其中1項(xiàng)有關(guān)EGCG在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型的研究中，觀察到EGCG與阿托伐他?。ˋTST）有相似的功效，并通過EGCG和ATST治療組的RNA微陣列數(shù)據(jù)的整合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，纖維化相關(guān)基因如Ⅰ型膠原 1、Ⅰ型膠原 2、Ⅲ型膠原1和Ⅵ型膠原3都出現(xiàn)明顯下調(diào)，證明EGCG確實(shí)有抑制肝纖維化的功效[11]。有學(xué)者研究過EGCG對體外培養(yǎng)的大鼠HSC侵襲和遷移的影響[12]。為了進(jìn)一步了解EGCG對肝纖維化的抑制作用，筆者研究ECGC對LX-2細(xì)胞生長狀態(tài)及活化表型的影響。利用RTCA系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測72h不同濃度EGCG對LX-2細(xì)胞生長狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示EGCG作用時(shí)間越長，細(xì)胞增殖抑制作用越明顯，EGCG濃度越高，細(xì)胞增殖抑制作用越明顯；而通過流式細(xì)胞術(shù)和倒置熒光顯微鏡均得到進(jìn)一步驗(yàn)證，EGCG能通過誘導(dǎo)凋亡的方式抑制LX-2細(xì)胞的增殖和活化。

本研究不僅通過RTCA動態(tài)監(jiān)測技術(shù)明確了EGCG對人肝星狀細(xì)胞株的藥物毒性反應(yīng)，也通過熒光染色利用不同的檢測技術(shù)明確了EGCG作用后的LX-2細(xì)胞生長狀態(tài)和活化標(biāo)志α-SMA的影響，為EGCG抗肝纖維化的藥物活性和機(jī)制研究提供更具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。來自單細(xì)胞基因和蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)研究的最新結(jié)果開始揭示先前未被充分認(rèn)識的HSC功能表型，該研究通過開發(fā)相關(guān)的數(shù)學(xué)模型，描述了HSC功能表型對肝臟再生的貢獻(xiàn)，并通過單個(gè)HSC的分離和轉(zhuǎn)錄表征的測試模型，將HSC功能表型的分布動態(tài)變化與嚴(yán)格調(diào)節(jié)的肝再生生理反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。結(jié)果鑒定出導(dǎo)致肝再生的4種HSC轉(zhuǎn)錄狀態(tài)（其中兩種為首次報(bào)道的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)），并揭示了不同轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的HSC表型之間的差異及這些表型的動態(tài)轉(zhuǎn)換如何控制肝再生的過程[13]。這為筆者的下一步研究帶來啟示，利用EGCG對HSC的抑制作用，除了能起到抗纖維化功效，是否還能干預(yù)不同HSC表型對肝再生的調(diào)控，成為抗肝纖維化和誘導(dǎo)肝再生的利器。