楊啟 呂新遠(yuǎn) 王哲

肝癌是較常見的惡性腫瘤之一，約80%肝癌患者合并乙型肝炎和肝硬化。有研究顯示[1-2]，約70%～80%乙肝相關(guān)肝癌患者確診時已為中晚期，其5年生存率極低，約為20%。早期評估乙肝相關(guān)肝癌病情及預(yù)后并采取針對性治療是提高其生存率的關(guān)鍵所在。近年來，雖然用于乙肝相關(guān)肝癌診斷的腫瘤標(biāo)志物有所增多，但尚無一種公認(rèn)度、敏感度和特異性均較高的可用于評價其病情、療效及預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。多項腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測將成為乙肝相關(guān)肝癌病情評估和預(yù)后判斷的趨勢。本研究分析乙肝相關(guān)肝癌患者血清微RNA-132(miR-132)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)水平，評估其在乙肝相關(guān)肝癌患者病情、療效和預(yù)后評估中的價值，以期為乙肝相關(guān)肝癌的治療提供參考。

資料和方法

一、 一般資料

前瞻性選取2015年2月至2017年2月我院就診的53例乙肝相關(guān)肝癌患者(乙肝相關(guān)肝癌組)、49例乙肝肝硬化患者(乙肝肝硬化組)、31例乙型肝炎患者(乙肝組)及40名健康體檢者(健康對照組)作為研究對象。乙肝相關(guān)肝癌組中男性35例，女性18例，年齡32～68歲，平均年齡(54.3±6.7)歲，均符合中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的2011版《原發(fā)性肝癌診斷指南》[3]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，臨床病理資料詳見表3。53例乙肝相關(guān)肝癌患者中，23例患者采用微波消融術(shù)治療、21例行根治性手術(shù)治療、6例行肝動脈栓塞化療術(shù)治療、3例患者采取靶向治療。乙肝肝硬化組中男性29例，女性20例，年齡31～67歲，平均年齡(52.5±7.3)歲；乙肝組男性18例，女性13例，年齡28～62歲，平均年齡(53.6±6.9)歲；均根據(jù)2010版《慢性乙型肝炎防治指南》[4]進(jìn)行診斷。健康對照組男性25例，女性15例，年齡28～66歲，平均年齡(54.7±5.8)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①乙肝相關(guān)肝癌患者、乙肝肝硬化患者和乙型肝炎患者均為初診患者；②不合并其他嚴(yán)重疾病，如心力衰竭、慢性腎功能衰竭等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕婦及哺乳期婦女；②HIV感染患者；③其他類型肝病患者；④合并其他惡性腫瘤患者。本研究四組患者在性別(χ2=0.737，P=0.865)、年齡(t=0.952,P=0.416)方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且所有受試者均簽署知情同意書。

二、 方法

收集乙肝相關(guān)肝癌患者的性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和門靜脈癌栓等臨床病理資料。檢測并記錄治療前乙肝相關(guān)肝癌患者、乙肝肝硬化患者、乙型肝炎患者和健康對照者血清miR-132、GPC3表達(dá)水平及乙肝相關(guān)肝癌患者治療1個月后血清miR-132、GPC3水平等。通過影像學(xué)成像、患者狀況改善程度及肝功能情況評價乙肝相關(guān)肝癌患者治療1個月后的臨床療效。對53例乙肝相關(guān)肝癌患者進(jìn)行為期1年的電話隨訪，觀察其1年生存情況。

三、 觀察指標(biāo)

抽取四組受試者空腹靜脈血10 mL，3500 r/min離心10 min,取上層血清，放置于-80℃環(huán)境中，待測。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測受試者血清GPC3蛋白水平(試劑盒購自Blue Gene公司)。采用化學(xué)發(fā)光法檢測血清甲胎蛋白水平(試劑盒及化學(xué)發(fā)光免疫分析儀均購自美國雅培公司)。采用RT-PCR法檢測血清中miR-132表達(dá)水平。首先用miRNeasy Mini Kit提取分離試劑盒(德國QIAGEN公司)提取血清中總miRNA,當(dāng)A260/A280介于1.8～2.0時，繼續(xù)后續(xù)操作。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)條件為16℃ 15 min,42℃ 1 h，85℃ 5 min。使用TaqMan microRNA Assay檢測血清miR-132的水平。用2-△Ct計算血清miR-132的表達(dá)水平，△Ct=Ct(miR-132)-Ct(U6)。miR-132、內(nèi)參U6引物序列均由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供。miR-132:上游5′-GCCGATAACAGTCTACAGC-3′,下游5′-CAG-TGCAGGGTCCGAGG-3′;U6:上游5′-GTGCGT-GTCGTGGAGTCG-3′,下游5′-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3′。相關(guān)檢測步驟嚴(yán)格遵從試劑盒及儀器說明書。

四、 統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、 miR-132、GPC3在四組受試者血清中的表達(dá)

四組受試者血清中miR-132、GPC3水平比較，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=141.228、F=19.859，均P<0.001)。乙肝相關(guān)肝癌組患者血清miR-132水平低于乙肝肝硬化組、乙肝組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U=-32.053、-82.088、-115.979，均P<0.05)。乙肝相關(guān)肝癌組患者血清GPC3水平高于乙肝肝硬化組、乙肝組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Q=6.474、8.090、9.890，均P<0.05)。詳見表1。

表1 四組受試者血清中miR-132、GPC3水平[M(Q1,Q3),]比較

注：與健康對照組比較，①P<0.05；與乙肝組比較，②P<0.05；與乙肝肝硬化組比較，③P<0.05

二、 血清miR-132、GPC3與乙肝相關(guān)肝癌患者臨床病理的關(guān)系

乙肝相關(guān)肝癌患者血清miR-132表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和門靜脈癌栓有關(guān)(P<0.05)，與患者的年齡、性別和腫瘤直徑無關(guān)(P>0.05)。血清GPC3表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和門靜脈癌栓均不相關(guān)(P>0.05)。詳見表2。

三、 乙肝相關(guān)肝癌患者治療前及治療1個月后血清miR-132、GPC3的動態(tài)變化

53例乙肝相關(guān)肝癌患者中，38例患者經(jīng)微波消融術(shù)、手術(shù)、肝動脈栓塞化療術(shù)或靶向治療后有效，腫瘤組織變小、患者狀況改善，肝功能恢復(fù)。38例乙肝相關(guān)肝癌患者血清miR-132水平升高，較治療前比較[3.8(1.9,5.5)對 1.1(0.9,1.4)×102]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.663，P<0.001)；GPC3水平降低，較治療前比較[(1.4±0.3)對(1.7±0.7)ng/mL]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.563，P=0.001)。

四、 乙肝相關(guān)肝癌患者1年生存情況

通過1年的電話隨訪得知，53例乙肝相關(guān)肝癌患者死亡13例，占24.5%，存活40例，占75.5%。

五、 血清miR-132、GPC3在不同預(yù)后乙肝相關(guān)肝癌患者的表達(dá)

乙肝相關(guān)肝癌生存組患者血清miR-132水平較死亡組患者高[1.2(1.0,2.0)對0.9(0.7,1.1)×102]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=3.118，P=0.002)；GPC3水平低于死亡組患者[(1.7±0.6)對(2.2±0.8) ng/mL]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.646，P=0.011)。

表2 血清miR-132、GPC3與乙肝相關(guān)肝癌患者臨床病理資料的關(guān)系

六、 血清miR-132、GPC3預(yù)判乙肝相關(guān)肝癌患者預(yù)后的價值

血清miR-132診斷乙肝相關(guān)肝癌患者預(yù)后的最大約登指數(shù)為0.398，其所對應(yīng)的最佳截斷點為1.2；血清GPC3診斷乙肝相關(guān)肝癌患者預(yù)后的最大約登指數(shù)為0.417，其所對應(yīng)的最佳截斷點為2.0 ng/mL。雖AUC miR-132>AUC GPC3、AUC聯(lián)合檢測>AUC miR-132，但均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.575，P=0.565；Z=1.698，P=0.089)；AUC聯(lián)合檢測>AUC GPC3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.412，P=0.016)。詳見圖1及表3。

圖1 miR-132、GPC3及聯(lián)合檢測預(yù)判乙肝相關(guān)肝癌患者預(yù)后的ROC曲線

表3 miR-132、GPC3及聯(lián)合檢測預(yù)判乙肝相關(guān)肝癌患者預(yù)后的效能

討 論

目前，我國肝癌患者病死率較高，僅次于胃癌和肺癌。隨著醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)的發(fā)展，越來越多的腫瘤標(biāo)志物被用于肝癌病情評估及預(yù)后診斷。有研究顯示[5-7]，miR-132可抑制肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，且與肝癌患者預(yù)后存在關(guān)聯(lián)；GPC3在正常和良性肝病肝細(xì)胞中不表達(dá)，其診斷肝癌的特異性較高。關(guān)于miR-132、GPC3的研究多數(shù)為組織學(xué)研究，鮮有血清學(xué)研究。因此，筆者檢測乙肝相關(guān)肝癌患者血清miR-132、GPC3表達(dá)水平，分析其與臨床病理資料的關(guān)系并觀察其1年生存情況，驗證其在乙肝相關(guān)肝癌病情、療效評估和預(yù)后診斷的價值。

研究表明[8]，miR-132在肝癌組織中低表達(dá)，其在肝癌中發(fā)揮抑癌作用。本研究結(jié)果顯示，乙肝相關(guān)肝癌患者血清miR-132水平下降，其原因可能是乙肝相關(guān)肝癌患者肝癌細(xì)胞內(nèi)miR-132表達(dá)減少，因此釋放到血液中的miR-132也隨之減少。本研究結(jié)果表明，乙肝相關(guān)肝癌患者血清miR-132表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和門靜脈癌栓有關(guān)，與沙敏等[9]研究結(jié)果一致。GPC3高表達(dá)于肝癌組織，其可錨在細(xì)胞表面，調(diào)控其增殖、分化和轉(zhuǎn)移等[10]。本次研究中，乙肝相關(guān)肝癌患者血清GPC3表達(dá)水平最高，與乙肝肝硬化患者、乙型肝炎患者及健康對照者比較，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過分析乙肝相關(guān)肝癌患者血清GPC3水平與臨床病理資料的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，其與患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和門靜脈癌栓均不相關(guān)，與多數(shù)學(xué)者研究結(jié)果一致。通過檢測經(jīng)手術(shù)、微波消融術(shù)、肝動脈栓塞化療術(shù)或靶向治療后有效的乙肝相關(guān)肝癌患者血清miR-132、GPC3水平，發(fā)現(xiàn)治療后血清miR-132表達(dá)水平升高，GPC3表達(dá)水平降低，提示血清miR-132、GPC3均可用于乙肝相關(guān)肝癌患者臨床療效評估。進(jìn)一步驗證血清miR-132、GPC3預(yù)判乙肝相關(guān)肝癌患者預(yù)后的價值，結(jié)果表明，GPC3診斷乙肝相關(guān)肝癌患者1年后死亡的敏感度為69.2%，特異性為72.5%，臨床價值較低。miR-132診斷乙肝相關(guān)肝癌患者1年后死亡的敏感度為92.3%，特異性為47.5%。miR-132和GPC3聯(lián)合檢測可提高乙肝相關(guān)肝癌患者預(yù)后診斷的效能。血清miR-132和GPC3檢測具有方便、快捷、無創(chuàng)且依從性高等特點，有助于了解肝癌患者病情、療效及預(yù)后評估。

本研究屬于單中心研究，樣本量偏少，下一步將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行多中心研究并驗證本實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。