薛揚(yáng) 郭宏強(qiáng)

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是以凝血機(jī)制障礙、高膽紅素血癥、黃疸、腹水、肝性腦病、肝腎綜合征以及多臟器功能衰竭等為主要表現(xiàn)的臨床癥候群[1]。我國(guó)90%的ACLF由乙型肝炎病毒(HBV)引發(fā)，稱為乙型肝炎病毒相關(guān)慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure，ACHBLF)。ACHBLF病死率高，病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，患者普遍預(yù)后差[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)能調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平后的基因翻譯[3]，其機(jī)制為結(jié)合信使RNA的3'端非翻譯區(qū)進(jìn)行調(diào)控，此外胚胎的發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化均與miRNA關(guān)系密切。miR-130a在急性心肌炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎炎中表達(dá)增加，提示miR-130a在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用。但目前尚無(wú)關(guān)于miRNA-130a與ACHBLF預(yù)后關(guān)系的研究報(bào)道。因此本研究擬分析血清miR-130a水平與ACHBLF患者預(yù)后的相關(guān)性，為ACHBLF的早期診斷、臨床治療以及預(yù)后效果分析提供理論及實(shí)踐依據(jù)。

資料和方法

一、一般資料

收集2013年7月至2017年6月本院收治ACHBLF患者110例，所有患者行血常規(guī)、血生化、尿常規(guī)、血清乙型肝炎兩對(duì)半(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)、血清HBV DNA等常規(guī)檢查，符合我國(guó)2012年《肝衰竭診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。 ACHBLF患者按照死亡結(jié)局分成生存組54例、死亡組56例，兩組在性別、年齡、病程等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，同時(shí)匹配本院體檢中心健康體檢者52名作為對(duì)照組?；颊呒凹覍俸炗喼橥鈺?shū)、通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

納入標(biāo)準(zhǔn)：可自由交流和溝通；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)血HBV DNA載量升高且肝功能異常；極度乏力，并有明顯厭食、嘔吐和腹脹等嚴(yán)重消化道癥狀；腹部肝膽B(tài)超及磁共振胰膽管造影排除先天性代謝性疾病、膽道閉鎖及其他原因所致的肝炎；未出現(xiàn)肝性腦病或明顯腹水；ALT持續(xù)或反復(fù)異常，或肝組織學(xué)檢查有肝炎病變。

排除標(biāo)準(zhǔn)：人類免疫缺陷病毒感染者、丁型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病、膽汁淤積性肝病、自身免疫性肝病患者、各種急慢性感染的患者，以及惡性腫瘤患者；其他病因引起的免疫復(fù)合物腎炎。

二、研究方法

(一)主要儀器及試劑

Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品)、miRNA-130a基因的表達(dá)測(cè)定采用UltraSYBR One Step RNA PCR Kit(寶生物工程大連有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)熱電公司)、NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司)、超凈工作臺(tái)(上海恒躍醫(yī)療器械有限公司)。

(二)血清miRNA-130a mRNA表達(dá)水平測(cè)定

患者清晨空腹靜脈抽血10 ml，置于普通無(wú)菌采血管中，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，用于測(cè)定miRNA-130a mRNA表達(dá)水平。參照GenBank 數(shù)據(jù)獲取 2 個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的序列，設(shè)計(jì)待測(cè)基因位點(diǎn)的PCR 擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物，按20 μL模板和 50 μL反應(yīng)液構(gòu)成 PCR反應(yīng)體系， 擴(kuò)增程序: 96 ℃ 6 min， 94 ℃ 15 s，65 ℃ 45 s，重復(fù) 60個(gè)循環(huán)，采集熒光。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀檢測(cè)其表達(dá)量。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、三組一般情況比較

生存組、死亡組在性別、年齡、病程、Alb、ALT、AST、HBV DNA、TBil等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；生存組、死亡組ALT、AST、TBil水平高于對(duì)照組，Alb水平低于對(duì)照組(P<0.05)。

二、對(duì)照組、ACHBLF組miRNA-130a mRNA表達(dá)水平比較

ACHBLF組miRNA-130a mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(1.98±0.68對(duì)0.67±0.14)(t=19.357，P<0.05)。

三、生存組、死亡組miRNA-130a、MELD評(píng)分、PT、PTA、APTT、INR比較

生存組miRNA-130a表達(dá)水平、APTT高于死亡組，MELD評(píng)分、PT、PTA、INR低于死亡組(t=12.127、10.712、14.413、8.241、9.387、13.298，P<0.05)。

表1 生存組、死亡組miRNA-130a、MELD評(píng)分、PT、PTA、APTT、INR比較

注：與生存組比較，bP<0.05

四、miRNA-130a與MELD評(píng)分、PT、PTA、APTT、INR相關(guān)性分析

miRNA-130a與MELD評(píng)分、PT、PTA、INR負(fù)相關(guān)明顯，與APTT正相關(guān)明顯(R=-0.654、-0.597、-0.593、-0.654、0.699，P<0.01)。

五、 mi RNA-130a、MELD評(píng)分對(duì)ACHBLF患者預(yù)后評(píng)估的診斷價(jià)值

受試者工作特征曲線提示，miRNA-130a ROC曲線下面積(AUC)為0.839(95%CI0.765～0.985)，MELD評(píng)分ROC曲線下面積(AUC)為0.777(95%CI0.587～0.903)，兩者AUC相近(P>0.05), miRNA-130a、MELD評(píng)分對(duì)ACHBLF患者預(yù)后評(píng)估的靈敏度、特異度相近(0.802對(duì)0.857, 0.746對(duì)0.789),(χ2=2.134、1.987，P>0.05)。

討 論

ACLF是在慢性肝病的基礎(chǔ)上，短期內(nèi)出現(xiàn)肝功能失代償為主要表現(xiàn)的一組臨床癥狀癥候群[5]。我國(guó)90%的ACLF由HBV引發(fā)，稱為ACHBLF。目前ACHBLF發(fā)病機(jī)制尚不明確，普遍認(rèn)為與免疫損傷，缺血缺氧和內(nèi)毒素血癥相關(guān)。ACHBLF死亡率高達(dá)60%～80%，病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，普遍預(yù)后差，嚴(yán)重威脅患者的健康。

研究發(fā)現(xiàn)外源性感染能引起miR-130a高表達(dá)，高度表達(dá)miR-130a蛋白的淋巴細(xì)胞株增殖能力明顯高于野生株[6]。本研究中，ACHBLF組miRNA-130a mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照，說(shuō)明ACHBLF患者肝細(xì)胞受損，miR-130a mRNA大量釋放入血，而生存組miRNA-130a mRNA表達(dá)水平明顯高于死亡組，提示miRNA-130a具有促進(jìn)ACHBLF患者良好預(yù)后的作用。 IL-8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)可能由miR-130a調(diào)控，高表達(dá)miR-130a蛋白的淋巴細(xì)胞可分泌更多的IL-8、VEGF，而VEGF、IL-8在炎癥的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7-9]。綜上所述，ACHBLF患者血清miRNA-130a 表達(dá)水平上升，高水平表達(dá)的miRNA-130a能促進(jìn)ACHBLF患者良好預(yù)后，其機(jī)制與miRNA-130a誘導(dǎo)免疫細(xì)胞因子產(chǎn)生有關(guān)。

本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，miRNA-130a與MELD評(píng)分、PT、PTA、INR負(fù)相關(guān)明顯，與APTT正相關(guān)明顯；而miRNA-130a、MELD評(píng)分ROC曲線下面積相近, miRNA-130a、MELD評(píng)分對(duì)ACHBLF患者預(yù)后評(píng)估的靈敏度、特異度相近；說(shuō)明miRNA-130a具有較高的靈敏度、特異度，可作為判定ACHBLF患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，值得在臨床上推廣應(yīng)用。