何雪麗，李云倩，宋雨瑩，呂曉芳，張蒙，廉文靜

（天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384）

鏈霉素是一種氨基糖苷類抗生素，對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌具有殺滅作用[1-2]。近年來(lái)，鏈霉素作為抗菌藥物被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)中[3]。長(zhǎng)期攝入含有超量鏈霉素的食品對(duì)人體有嚴(yán)重的副作用，如:過(guò)敏反應(yīng)、腎毒性、耳毒性等[4]。因此，探索快速、靈敏檢測(cè)鏈霉素的方法具有非常重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

電化學(xué)分析方法具有檢測(cè)靈敏度高、簡(jiǎn)單快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于各類物質(zhì)的分析檢測(cè)中。分子印跡技術(shù)模擬自然界中天然分子識(shí)別系統(tǒng)的特異性識(shí)別作用，具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[5]。近年來(lái)，將分子印跡技術(shù)與電化學(xué)分析方法結(jié)合構(gòu)建分子印跡電化學(xué)傳感器已成為一種非常有前景的分析方法[6]。

本研究結(jié)合分子印跡技術(shù)與電化學(xué)檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)，以鏈霉素為模板分子，吡咯為功能單體，利用簡(jiǎn)單電聚合方法制備特異識(shí)別鏈霉素的分子印跡聚合物（MIP） 膜，構(gòu)建鏈霉素分子印跡電化學(xué)傳感器。通過(guò)對(duì)傳感器測(cè)定條件優(yōu)化選擇，實(shí)現(xiàn)鏈霉素的快速、靈敏檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器:CHI660E型電化學(xué)工作站；三電極系統(tǒng)（鉑絲對(duì)電極，飽和甘汞參比電極，金工作電極）；BSA223S型電子天平；KH5200B型超聲波清洗儀；HWCL-3型恒溫磁力攪拌器。

試劑:硫酸鏈霉素、硫酸新霉素、硫酸慶大霉素、紅霉素、吡咯（購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司）；氯化鈉、氫氧化鈉（購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司）；鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（購(gòu)于北京化工廠），以上試劑均為分析純。拋光氧化鋁粉（購(gòu)于天津艾達(dá)恒晟科技有限公司），牛奶樣品購(gòu)于本地市場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 金電極預(yù)處理

將金電極依次用1 μm、0.3 μm和50 nm粒徑的氧化鋁粉拋光處理，然后將處理后的金電極置于蒸餾水中超聲震蕩30 s，得到表面光潔的金電極。

1.3 鏈霉素分子印跡傳感器的制備

將三電極系統(tǒng)置于含有10 mmol/L鏈霉素和30 mmol/L吡咯的pH 6.8的磷酸緩沖液中，利用循環(huán)伏安（CV）法在金電極表面電聚合得到MIP膜（掃速0.05 V/s，聚合電位為0～1.4 V，聚合圈數(shù)為5圈）。將電聚合后的MIP薄膜電極室溫晾干后，置于0.1 mol/L氫氧化鈉洗脫液中磁力攪拌15 min除去模板分子鏈霉素，得到對(duì)鏈霉素具有特異識(shí)別作用的洗脫后的MIP薄膜電極。

1.4 電化學(xué)檢測(cè)

采用三電極系統(tǒng)利用CV法在含有5 mmol/L鐵氰化鉀和0.5 mol/L氯化鉀的水溶液中進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)（掃速0.05 V/s，掃描電位為0.2～0.6 V，掃描圈數(shù)為3圈，選擇第3圈穩(wěn)定數(shù)據(jù)作為測(cè)定結(jié)果）。所有電化學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均在室溫條件進(jìn)行。

1.5 實(shí)際樣品制備

實(shí)際牛奶樣品從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)得，按照牛奶樣品與蒸餾水體積比為1∶4的比例對(duì)牛奶樣品進(jìn)行稀釋，然后利用無(wú)菌微孔過(guò)濾膜（0.22 μm） 將稀釋后的牛奶樣品過(guò)濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器構(gòu)建過(guò)程的循環(huán)伏安表征

以鐵氰化鉀為探針，采用三電極系統(tǒng)利用CV法在含有5 mmol/L鐵氰化鉀和0.5 mol/L氯化鉀的水溶液中對(duì)傳感器構(gòu)建過(guò)程進(jìn)行表征。測(cè)定結(jié)果如圖1所示。裸金電極的CV曲線有一對(duì)可逆的氧化還原峰（曲線a）。當(dāng)在金電極表面電聚合一層MIP膜后，電極的氧化還原峰電流明顯降低（曲線b），這是因?yàn)殡娋酆虾笤诮痣姌O表面形成的緊密MIP膜阻礙了鐵氰化鉀探針在電極表面的電化學(xué)反應(yīng)。當(dāng)利用洗脫劑洗脫掉模板分子鏈霉素后，電極的電流響應(yīng)明顯增強(qiáng)（曲線c），這是由于洗脫后，MIP膜表面很有很多鏈霉素的識(shí)別位點(diǎn)，MIP膜變成多孔結(jié)構(gòu)，有助于鐵氰化鉀探針穿過(guò)孔穴到達(dá)電極表面，發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)。將洗脫后的電極置于1.00×10-5mol/L鏈霉素溶液中進(jìn)行重結(jié)合，發(fā)現(xiàn)重結(jié)合后，電極的電流響應(yīng)明顯降低（曲線d），這是因?yàn)橹亟Y(jié)合后，MIP膜上鏈霉素的特異性識(shí)別位點(diǎn)重新被占據(jù)，MIP膜上的立體孔穴數(shù)量明顯變少，阻礙了鐵氰化鉀的電化學(xué)反應(yīng)。CV表征表明:構(gòu)建的鏈霉素分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)鏈霉素具有識(shí)別作用，可以利用洗脫及重結(jié)合后電極的氧化峰電流差值ΔIpa與鏈霉素濃度c之間的關(guān)系對(duì)被測(cè)鏈霉素進(jìn)行定量分析。

2.2 測(cè)定條件優(yōu)化

在分子印跡電化學(xué)傳感器構(gòu)建過(guò)程中，模板分子與功能單體的比例、電聚合圈數(shù)、洗脫時(shí)間及重結(jié)合時(shí)間對(duì)傳感器的穩(wěn)定性和分析性能有很大的影響。因此，本研究利用CV表征對(duì)傳感器的構(gòu)建及測(cè)定條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇，經(jīng)優(yōu)化發(fā)現(xiàn):模板分子與功能單體的摩爾比為1∶3，電聚合圈數(shù)為5圈，洗脫時(shí)間和重結(jié)合時(shí)間均為15 min時(shí)，傳感器的電流響應(yīng)最大，穩(wěn)定性和檢測(cè)靈敏度最強(qiáng)。

圖1 傳感器構(gòu)建過(guò)程循環(huán)伏安圖，

2.3 校準(zhǔn)曲線的繪制

在最優(yōu)化條件下，用該傳感器測(cè)定5.00×10-9～1.00×10-3mol/L濃度的鏈霉素，先測(cè)定鐵氰化鉀探針溶液在洗脫后電極上的CV氧化峰電流Ipa1，然后將洗脫后的電極浸入到不同濃度鏈霉素溶液中重結(jié)合15 min，測(cè)定鐵氰化鉀在重結(jié)合后電極上的的CV氧化峰電流Ipa2。

根據(jù)鏈霉素濃度c與洗脫及重結(jié)合后電極的氧化峰電流差值ΔIpa（ΔIpa=Ipa1-Ipa2）的關(guān)系繪制傳感器的校準(zhǔn)曲線，如圖2所示。傳感器的線性范圍為 5.00×10-8～8.00×10-5mol/L，線性方程為ΔIpa(A)=6.062 (A)+0.056394c(mol/L)(r=0.996)，LOD 為 3.45×10-8mol/L(S/N=3)。

圖2 傳感器檢測(cè)鏈霉素的校準(zhǔn)曲線

2.4 傳感器的選擇性、重復(fù)性及穩(wěn)定性研究

選擇性研究:為了研究該傳感器對(duì)鏈霉素的特異選擇性，選擇鏈霉素的三種結(jié)構(gòu)類似物（新霉素，慶大霉素，紅霉素）作為干擾物質(zhì)，利用傳感器對(duì)1.00×10-5mol/L鏈霉素及1.00×10-4mol/L新霉素，1.00×10-4mol/L慶大霉素和1.00×10-4mol/L紅霉素進(jìn)行測(cè)定。CV測(cè)定結(jié)果如圖3所示。傳感器對(duì)鏈霉素的電流響應(yīng)遠(yuǎn)大于對(duì)三種干擾物質(zhì)的電流響應(yīng)，說(shuō)明該傳感器對(duì)鏈霉素具有很強(qiáng)的特異選擇性。

圖3 傳感器的選擇性

重復(fù)性研究:利用相同的方法構(gòu)建5個(gè)鏈霉素分子印跡電化學(xué)傳感器，并對(duì)5.00×10-6mol/L鏈霉素進(jìn)行測(cè)定，5次測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.9%，說(shuō)明該傳感器具有良好的重復(fù)性。

穩(wěn)定性研究:利用相同的方法構(gòu)建3個(gè)鏈霉素分子印跡電化學(xué)傳感器，并對(duì)5.00×10-6mol/L鏈霉素進(jìn)行測(cè)定并記錄測(cè)定的氧化峰電流值。然后將3個(gè)傳感器室溫放置10天后再對(duì)5.00×10-6mol/L鏈霉素進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)測(cè)定的氧化峰電流值約為初次測(cè)定的93%，說(shuō)明該傳感器具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，放置一段時(shí)間后，仍然可以用于鏈霉素的測(cè)定。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了研究該傳感器的實(shí)際應(yīng)用性，利用該傳感器對(duì)市售牛奶樣品進(jìn)行測(cè)定，未檢出鏈霉素，說(shuō)明牛奶樣品中不含鏈霉素或該傳感器靈敏度不夠高，牛奶樣品中鏈霉素含量低于傳感器的LOD。因此，采用加標(biāo)測(cè)定法，在牛奶樣品中加入 3種濃度 （1.00×10-6mol/L,5.00×10-6mol/L,1.00×10-5mol/L） 的鏈霉素后，利用該傳感器對(duì)加標(biāo)后的牛奶樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表1所示，回收率為95%～106%，平行樣品測(cè)定的RSD為4.3%～5.2% (n=3)，說(shuō)明該傳感器適用于實(shí)際樣品中鏈霉素的定量測(cè)定。

3 結(jié)論

本研究分別以鏈霉素、吡咯為模板分子、功能單體為樣本，利用簡(jiǎn)單電化學(xué)聚合方法制備得到對(duì)鏈霉素具有特異識(shí)別作用的MIP膜。通過(guò)對(duì)傳感器測(cè)定條件優(yōu)化選擇，得到該傳感器在5.00×10-8～8.00×10-5mol/L 范圍內(nèi)對(duì)鏈霉素呈良好線性，LOD為3.45×10-8mol/L。該傳感器具有良好的選擇性、重復(fù)性和再現(xiàn)性，并在實(shí)際樣品測(cè)定中得到了很好的回收率。該研究為食品中鏈霉素的快速、靈敏分析提供了簡(jiǎn)單、高效的方法。

表1 牛奶樣品加標(biāo)檢測(cè)鏈霉素