付凱飛 李 軍 王欲曉 吳成林 欽可為 周麗君

[1. (原)海軍總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科，北京 100048][2. (原)海軍總醫(yī)院科研科，北京 100048]

對于人和動(dòng)物而言，機(jī)體內(nèi)微生物菌群的穩(wěn)態(tài)在機(jī)體的生存和健康方面發(fā)揮著異常關(guān)鍵的作用，某種常駐微生物的比例失衡會導(dǎo)致整個(gè)微生物穩(wěn)態(tài)的破壞，繼而誘發(fā)疾病的產(chǎn)生[1]。而菌群感應(yīng)(quorum sensing, QS)現(xiàn)象是普遍存在于細(xì)菌群體內(nèi)的一種通過自身合成的信號分子感知周圍環(huán)境，并進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌密度和生理功能的自調(diào)控現(xiàn)象[2]。其中AHLs是革蘭陰性菌QS系統(tǒng)中最重要的一類信號分子，可以調(diào)控細(xì)菌多種生理特性的表達(dá)，也是近年來的研究熱點(diǎn)。然而，AHLs是否會干擾機(jī)體一定區(qū)域內(nèi)微生物菌群的多樣性構(gòu)成以及整個(gè)微生態(tài)穩(wěn)定，尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究主要采用外源性菌群感應(yīng)信號分子3-oxo-C10-HSL為作用因素，通過16 s rRNA高通量測序平臺分析小鼠腸道內(nèi)的微生物種類和多樣性變化情況，以期對AHLs在機(jī)體微生物菌群調(diào)節(jié)方面的作用有更深入的了解，為疾病狀態(tài)下致病菌的預(yù)防和臨床治療提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6周齡SPF級BALB/c健康雌鼠12只，體質(zhì)量(16.5±2)g/只，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證：SCXK-(軍) 2012-0004；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK-(軍) 2012-0012。

1.1.2試劑與耗材：N-(3-oxodecanoyl) homoserine lactone (3-oxo-C10-HSL, AR級)購于北京瀚普醫(yī)藥有限公司；玉米油(AR級)購于上海阿拉丁公司；無水乙醇購于國藥試劑有限公司；通用細(xì)菌采樣管購于友康基業(yè)生物科技公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購于天根生物有限公司；KAPA Taq PCR Kits購于KAPA Biosystems 公司；MinElute膠回收試劑盒購于QIAGEN 公司；NEB Next? UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒購于New England Biolabs 公司。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組與樣品采集：BALB/c小鼠在25～26 ℃下飼養(yǎng)，統(tǒng)一喂食，自由飲水，飼養(yǎng)至6周齡，體質(zhì)量為(18.5±2)g/只，隨機(jī)分為對照組和3-oxo-C10-HSL 處理組，每組6只。將用玉米油稀釋的3-oxo-C10-HSL工作液(50 mmol/L)采用腹腔注射法處理小鼠，對照組單純注射玉米油。首次注射后24 h以拭子涂抹法分別在十二指腸及空回腸部位進(jìn)行采樣(C1為對照組十二指腸部位樣品；C2為對照組空回腸部位樣品；A1為AHLs處理組十二指腸部位樣品；A2為AHLs處理組空回腸部位樣品)，取樣后迅速置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2DNA提取與文庫構(gòu)建：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京TIANGEN公司)提取宏基因組DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA V3-V4區(qū)，通用引物為340F: CCTACGGGNBGCASCAG，805R：GACTACNV GGGTATCTAATCC。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后混樣構(gòu)建文庫，對文庫進(jìn)行Qubit定量和檢測，篩選合格文庫。

1.2.316S rDNA測序與序列優(yōu)化處理：合格文庫采用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺對16 s rRNA V3-V4區(qū)域測序進(jìn)行雙端測序，測序長度為250 bp。利用FastQC軟件對原始序列質(zhì)量進(jìn)行評估后，Trimmomatic軟件做質(zhì)控，過濾低Q值reads后重新進(jìn)行評估，利用FLASh(Fast Length Adjustment of Short reads)軟件根據(jù)PE reads間overlap關(guān)系將通過質(zhì)控的成對 reads 拼接成一條序列，得到tags序列。

1.2.4OTU生成及豐度分析：利用QIIME(Quantitative Insights Into MicrobialEcology)軟件包[3]進(jìn)行OTU及多樣性分析。用usearch61軟件進(jìn)行嵌合體序列的去除[4-5]和uclust法[5]對序列進(jìn)行97%相似水平聚類，得到所有OTU；RDP Classifier法[6](confidence cutoff=0.8)對OTU進(jìn)行分類學(xué)(Taxonomy)注釋。同時(shí)計(jì)算α多樣性指數(shù)，包括Chao1指數(shù)[7]、Shannon-Wiener指數(shù)[8]及Simpson指數(shù)，并繪制指數(shù)曲線。

1.2.5物種分類比較及β多樣性分析：根據(jù)OTU分類學(xué)注釋結(jié)果對每組微生物菌群進(jìn)行物種分類。

1.2.6OTU及物種組間差異分析：根據(jù)組內(nèi)平均OTU豐度，利用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法wilcox檢驗(yàn)分別對不同分組樣品物種進(jìn)行顯著性差異分析，找出組間顯著差異的OTU及物種，差異顯著性水平定義為P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 樣本數(shù)據(jù)量的統(tǒng)計(jì)及高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)的篩選與統(tǒng)計(jì)

Illumina高通量測序共得到122 828～364 726個(gè)原始reads，堿基總量為30.71～90.18 Mbp，軟件Trimmomatic質(zhì)控后優(yōu)質(zhì)reads在112 388～339 376之間，堿基總量在27.87～84.23Mbp之間，質(zhì)量評分30分以上的占90.21%以上，表明質(zhì)控后數(shù)據(jù)量足夠，數(shù)據(jù)質(zhì)量高。將質(zhì)控后reads根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系利用flash軟件將成對序列拼接為完整數(shù)據(jù)對，得到有效序列大于50 912條，平均長度大于459.98 bp，數(shù)據(jù)量足夠，序列質(zhì)量高，符合下游實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 小鼠腸道微生物菌群多樣性分析

2.2.1樣品OTU聚類結(jié)果：根據(jù)97%的相似性水平對腸道樣品進(jìn)行OTU聚類，按分組內(nèi)樣品平均OTU聚類結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。如圖1a所示，4組樣品的測序量依次增多時(shí)，chao1指數(shù)增長逐漸放緩，測序量再增多對chao1指數(shù)的增長無太大貢獻(xiàn)，表明各組樣品測序合理，測序量已經(jīng)足夠，基本覆蓋了組內(nèi)所有的物種。chao1豐度指數(shù)提示，3-oxo-C10-HSL(A1和A2組)對小鼠十二指腸部位和空回腸部位內(nèi)微生物菌群多樣性均有抑制，其中對十二指腸部位菌群的多樣性抑制明顯，空回腸部位內(nèi)菌群多樣性抑制略差。

2.2.2樣品中微生物多樣性結(jié)果：根據(jù)OTU聚類統(tǒng)計(jì)，利用shannon指數(shù)公式構(gòu)建分組內(nèi)樣品平均多樣性水平shannon-wiener指數(shù)曲線。如圖1b所示，4組樣品的shannon指數(shù)曲線并不隨測序深度的增加而增大，而是趨于平坦，表明各組樣品測序深度足夠，測序量合理，基本覆蓋了組內(nèi)所有的微生物群落。Shannon多樣性指數(shù)提示，3-oxo-C10-HSL(A1和A2組)可提高小鼠十二指腸部位和空回腸部位內(nèi)的微生物多樣性，其中對十二指腸部位微生物的多樣性提高明顯，空回腸部位內(nèi)微生物多樣性提高程度略差。

圖1 小鼠腸道不同樣品組微生物菌群多樣性分析注：a: chao1指數(shù)分析；b: shannon-wiener指數(shù)分析Fig.1 Microbial flora diversity analysis of different mice intestine samples groupsNote:a: chao1 analysis；b: shannon-wiener analysis

2.3 小鼠腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

門水平菌群結(jié)構(gòu)分析：小鼠腸內(nèi)共檢測出22個(gè)門的細(xì)菌，主要以厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為主。同一取材部位不同處理組相比較，外源3-oxo-C10-HSL對菌群門水平的影響無顯著差異；但同一組別內(nèi)不同取材部位的樣品門水平菌群分布差別較大，在十二指腸部位，對照組及3-oxo-C10-HSL處理組厚壁菌門百分比分別為69%和75.47%，遠(yuǎn)高于變形菌門(21.01%和24.27)，而在空回腸部位，兩組內(nèi)厚壁菌門和變形菌門分布水平較相近(45.22%～50.92%)。見表1。

表1 小鼠腸道主要細(xì)菌占比情況表[序列標(biāo)簽(tags)百分比，n(%)]Table 1 The proportion of dominant bacteria inmice intestine [tags percentage, n(%)]

屬水平菌群結(jié)構(gòu)分析：小鼠腸內(nèi)共檢測出109個(gè)細(xì)菌屬，主要有葡萄球菌屬(Staphylococcus)、埃希氏菌-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、變形桿菌屬(Proteus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、(Lysinibacillus)、短波單胞桿菌屬(Brevundimonas)及擬桿菌屬(Bacteroides)等。外源3-oxo-C10-HSL作用后，腸內(nèi)不同部位菌群構(gòu)成均有明顯變化，如圖2所示，對照組十二指腸部位微生物菌群主要以葡萄球菌屬為主，其次為假單胞菌屬，3-oxo-C10-HSL作用后，這兩個(gè)細(xì)菌屬水平分別由67.7%、18.43%降至36.19%和0.01%，大腸桿菌-志賀菌屬和腸球菌屬水平顯著上升；對照組空回腸部位微生物菌群主要以大腸桿菌-志賀菌屬為主，其次為乳球菌屬，3-oxo-C10-HSL作用組葡萄球菌屬和腸球菌屬水平明顯上升，乳球菌屬水平大幅度下降。

2.4 小鼠腸道微生物菌群物種豐度分析

將C1、C2、A1、A2樣品組內(nèi)屬物種豐度相加，按照從大到小進(jìn)行排序，選取top50(unclassified除外)的屬物種進(jìn)行熱圖分析(圖3a)，其中顏色從藍(lán)到紅，表示對應(yīng)的菌落豐度由小到大，結(jié)果顯示豐度最高的菌屬為大腸桿菌-志賀菌屬，而菌落豐度最高的樣品組為A2組。利用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)wilcox檢驗(yàn)分別對各組樣本聚類OTU進(jìn)行顯著性差異分析，3-oxo-C10-HSL處理后(A1和A2組)十二指腸部位和空回腸部位均有顯著差異變化的OTU共有13個(gè)，分類結(jié)果顯示分別屬于葡萄球菌屬、腸球菌屬和大腸桿菌-志賀菌屬。對于十二指腸部位取材樣本，除OTU120(葡萄球菌屬)豐度顯著下降外，其余12個(gè)差異顯著OTU(腸球菌屬和大腸桿菌-志賀菌屬)豐度均增加(見圖3b)；對于空回腸部位樣品，OTU120、OTU213、OTU337、OTU387、OTU594、OTU727、OTU745和OTU774豐度顯著上升，OTU266、OTU268、OTU315、OTU428和OTU450豐度顯著下降，即顯著提高葡萄球菌屬、腸球菌屬的豐度，但抑制大腸桿菌-志賀菌屬的豐度(見圖3c)。

圖2 3-oxo-C10-HSL 作用24 h小鼠腸內(nèi)不同部位屬水平菌群的變化Fig.2 Changes of the intestinal bacteria genus at different positions after3-oxo-C10-HSL treatment for 24 h in mice intestine

圖3 不同樣品組小鼠腸道微生物菌群物種豐度分析注： a： 各組樣本在屬水平的菌落豐度熱圖； b： 外源3-oxo-C10-HSL對小鼠十二指腸部位微生物菌群聚類OTU的調(diào)控；c： 外源3-oxo-C10-HSL對小鼠空回腸部位微生物菌群聚類OTU的調(diào)控)Fig.3 The intestinal microbial flora abundance analysis of different sample groupsNote： a： The heatmap of different group samples on the genus level; b： The regulation of exogenous 3-oxo-C10-HSL on mice duodenum microbial community OTU; c： The regulation of exogenous 3-oxo-C10-HSL on mice jejuno-ileum microbial community OTU

3 討論

在細(xì)菌對宿主的感染機(jī)制研究中，除了細(xì)菌本身產(chǎn)生的毒力因子、生物膜等參與感染過程，在細(xì)菌生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用的AHLs信號分子也不容忽視。研究證實(shí)，長鏈AHLs可參與調(diào)控多種致病菌的多種生理功能，還可引發(fā)宿主機(jī)體的免疫失調(diào)，如，3-oxo-C10-HSL可提高銅綠假單胞菌的抗生素耐藥性[9]，3-oxo-C12-HSL可引起宿主炎癥反應(yīng)和其他免疫系統(tǒng)應(yīng)激[10-12]，C12-HSL可增加空回腸部位沙門氏菌生物膜的形成[13]，增強(qiáng)其耐藥性。而在AHLs作用下，機(jī)體內(nèi)微生物含量最豐富的部位——腸道微生物穩(wěn)態(tài)是否也會受到影響，目前尚不明確。

大量研究已證實(shí)，人和多種動(dòng)物的腸道內(nèi)都蘊(yùn)含著極其復(fù)雜多樣的微生物群落[14-15]，在機(jī)體健康狀態(tài)下，這些微生物群落內(nèi)部各種群間生長擴(kuò)繁維持在穩(wěn)定的狀態(tài)，形成微生物穩(wěn)態(tài)[16]。而當(dāng)機(jī)體處于異常狀態(tài)下，如感染、內(nèi)分泌失衡等疾病狀態(tài)或飲食結(jié)構(gòu)改變等情況下，腸道內(nèi)的微生物穩(wěn)態(tài)也會被打破，并可能進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生相應(yīng)的機(jī)能變化[17-18]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)和各種新的種系聚類方法對微生物群落結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展，極大促進(jìn)了人們對腸道微生物的深入了解。本研究即是通過Illumina Hiseq 2500測序平臺，運(yùn)用16S rDNA高通量測序技術(shù)[19-20]分析3-oxo-C10-HSL作用后小鼠腸道的微生物組多樣性變化情況，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測方法中體外培養(yǎng)分離微生物種類有限的弱點(diǎn)，通過分析精準(zhǔn)的大信息量數(shù)據(jù)以明確菌群感應(yīng)信號分子對小鼠腸道微生物多樣性的影響，可以為感染性疾病的相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

本研究通過對樣品16S rDNA擴(kuò)增的V3-V4區(qū)域測序，在小鼠腸道內(nèi)共檢測到16個(gè)細(xì)菌門類，47個(gè)細(xì)菌屬類。在3-oxo-C10-HSL信號分子作用下，腸道相同部位菌群門水平的分布無明顯變化，但可影響相同取材部位菌群屬水平的分布構(gòu)成，主要表現(xiàn)為降低葡萄球菌屬(十二指腸部位)、假單胞菌屬及乳球菌屬分布水平，而增加大腸桿菌-志賀菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬(空回腸部位)和腸球菌屬水平，且3-oxo-C10-HSL對不同部位的葡萄球菌屬作用亦不同。此種現(xiàn)象說明，外源AHLs不僅可調(diào)控多種革蘭陰性菌的比例，亦可調(diào)控部分革蘭陽性菌的比例，其調(diào)控可能涉及如下因素：一是外源3-oxo-C10-HSL改變了周圍環(huán)境中的不同種類AHLs分子的比例，并進(jìn)而影響了AHLs在菌體內(nèi)的綜合調(diào)控效應(yīng)，造成了細(xì)菌種群構(gòu)成的上升或下降，這一點(diǎn)與Swift 等在Aeromonashydrophila中的研究相似[21]；二是AHLs分子雖然主要由革蘭陰性菌產(chǎn)生，但近年研究也發(fā)現(xiàn)個(gè)別革蘭陽性菌也會產(chǎn)生AHLs分子[22]，說明不同細(xì)菌種群間的菌群感應(yīng)系統(tǒng)存在復(fù)雜的信號交流機(jī)制，可以相互影響，Winzer等學(xué)者的研究也為這一理論做了支持[23]。

本文研究提示，小鼠腸道細(xì)菌基因組含量豐富，且不同部位微生物分布構(gòu)成存在差異，并與菌群感應(yīng)信號分子存在密切聯(lián)系。研究獲得的相關(guān)研究數(shù)據(jù)對于探尋機(jī)體腸道微生物菌群分布失衡調(diào)控機(jī)制，以及腸道感染性疾病的防治提供了新的思路。