童 慶 吳曉軍 張盼紅 艾 彩 唐子涵 張景瑜 徐 雅 趙 勤

(西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院藏藥篩選實驗室、生命科學(xué)基礎(chǔ)實驗室，咸陽 712082)

阿爾茨海默病(AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床上首先表現(xiàn)為近期記憶能力減退，進而表現(xiàn)為持續(xù)性智力衰退、喪失判斷推理能力以及運動功能等，為了尋求有效的老年性癡呆治療藥物，動物行為學(xué)實驗被廣泛地應(yīng)用[1]。在阿爾茨海默病(AD)的動物實驗研究中,學(xué)習(xí)記憶能力測試是一項重要的行為學(xué)指標。在小鼠實驗中,避暗實驗法和Morris水迷宮實驗法是測定學(xué)習(xí)記憶較為常用的方法，但目前有關(guān)建立小鼠記憶損傷模型的方法并不規(guī)范，檢測指標和合適時間不統(tǒng)一，給研究者帶來困惑和容易干擾實驗結(jié)果，本文通過探索不同藥物對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，建立小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型的有效方法。其研究結(jié)果可能對神經(jīng)性疾病的同行研究者篩選學(xué)習(xí)記憶障礙的治療藥物有一定的提示作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗于 2017-12-28—2018-01-05在西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物行為學(xué)實驗室完成。動物為健康雄性昆明種小鼠70只，體質(zhì)量(25±2)g，清潔級，由四川達碩實驗動物室提供(動物合格證號：SYXK(川)2014-189)。所有小鼠先在實驗室適應(yīng)2 d，確定其活動、進食均無異常后方可用于實驗。

試劑與儀器：氫溴酸東莨菪堿為遂成藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；亞硝酸鈉為湖南省湘中地質(zhì)實驗研究所產(chǎn)品；無水乙醇為天津天力化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。BA-200小鼠避暗儀購自成都泰盟科技有限公司。避暗箱為 40 cm×12 cm×12 cm的被動回避性條件反射箱，分明暗兩室，箱底有銅柵，暗室底部銅柵可通 36 V電流，明暗兩室間有一直徑為3.0 cm的洞口。Morris水迷宮和計算機自動控制和圖像分析處理系統(tǒng)均由北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司研發(fā)。Morris水迷宮計算機圖像實時檢測分析處理系統(tǒng)硬件部分包含可移動圓形恒溫水池(直徑160 cm，高40 cm)、配套圓柱形防滑平臺(直徑9 cm，高25 cm)、溫控系統(tǒng)、水循環(huán)系統(tǒng)、視頻攝像系統(tǒng)，系統(tǒng)軟件可自動記錄小鼠運動軌跡并實現(xiàn)圖像的實時檢測分析與處理。

1.2 方法

避暗實驗:40只小鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為四組，空白組10只，東莨菪堿組10只，乙醇組10只，亞硝酸鈉組10只。訓(xùn)練前將小鼠頭背著洞口放入明室，先適應(yīng)環(huán)境2 min，待其全部進入暗箱之后，關(guān)閉明室和暗室之間的閘門，然后給暗室銅柵通以36v電流，使小鼠在暗室持續(xù)電擊5 min，此為訓(xùn)練過程。6 h、24 h、30 h、48 h后分別對小鼠進行記憶測驗，記錄小鼠第一次進入暗室的時間，此為避暗潛伏期，并記錄5 min 內(nèi)小鼠進入暗室的次數(shù)(即避暗錯誤次數(shù))和小鼠主動將頭部升入暗室進行探索的次數(shù)(探頭次數(shù))，5 min內(nèi)未進入暗室的小鼠其潛伏期按300 s計算[2]。

Morris水迷宮實驗：30只小鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為三組，空白組10只，東莨菪堿組10只，乙醇組10只，Morris水迷宮實驗包括定航實驗和主動探索實驗。前4 d為定航實驗，每天訓(xùn)練4次，每次從不同的入水點將小鼠面向池壁放入水池。水面高出平臺1 cm，水中加入適量墨汁，使小鼠看不到平臺，溫度維持在22～24 ℃。測試時間為90 s，在平臺上停留超過2s即為尋臺成功。每次測試前小鼠在平臺上有10 s的前適應(yīng)，測試完畢無論成功與否還有10 s的后適應(yīng)。小鼠從入水到尋臺成功所需時間記作逃避潛伏期，尋臺失敗則逃避潛伏期記作90 s，每一天訓(xùn)練4次結(jié)果的平均值作為當天訓(xùn)練的總結(jié)果。第5天為探索實驗，撤去平臺，選擇平臺所在象限對角象限作為入水點，記錄90 s內(nèi)小鼠的穿臺次數(shù)[3]。

避暗實驗?zāi)Ｐ徒ⅲ孩儆洃洬@得障礙模型 在動物進行電擊訓(xùn)練之前15～20 min，給動物腹腔注射氫溴酸東莨菪堿(膽堿能M受體拮抗劑,1 mg/kg)，②記憶鞏固障礙模型 動物電擊訓(xùn)練結(jié)束后立即給動物皮下注射NaNO2(小鼠：90 mg/kg)導(dǎo)致動物短暫性缺氧。③記憶再現(xiàn)障礙模型 于動物下次測試之前15 min給小鼠灌服乙醇(35%，0.1 mL/10 g體質(zhì)量)，15 min后進行重測試[3]。

Morris水迷宮實驗?zāi)Ｐ徒ⅲ孩儆洃洬@得障礙模型 在動物進行定航和主動探索實驗之前15～20 min，給動物腹腔注射氫溴酸東莨菪堿(膽堿能M受體拮抗劑，1 mg/kg)，②記憶再現(xiàn)障礙模型 于動物下次測試之前15 min給小鼠灌服乙醇(35%，0.1 mL/10 g體質(zhì)量)，15 min后進行重測試。

主要觀察指標：避暗實驗中的避暗潛伏期、避暗錯誤次數(shù)、小鼠將頭部及前爪全部伸入洞口的次數(shù)(簡稱探頭次數(shù))；Morris水迷宮實驗中的每次訓(xùn)練定位航行逃避潛伏期的時間和主動探索穿越平臺的次數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 避暗實驗結(jié)果

2.1.1東莨菪堿對小鼠記憶獲得過程的影響：由圖1,圖2可知，與空白組相比，給予東莨菪堿后6 h，小鼠避暗錯誤次數(shù)明顯增多(P<0.01), 同時小鼠避暗潛伏期時間明顯縮短(P<0.05)。24 h后小鼠避暗錯誤次數(shù)仍然明顯增多(P<0.01), 同時小鼠避暗潛伏期時間仍明顯縮短(P<0.05)。30 h后小鼠避暗錯誤次數(shù)無差異，避暗潛伏期仍縮短(P<0.05)，48 h后小鼠避暗錯誤次數(shù)和避暗潛伏期時間均無差異。從圖3可見，給予東莨菪堿30 h、48 h后小鼠將頭部和前爪探入暗箱的次數(shù)(簡稱探頭次數(shù))明顯增加，與空白組相比有顯著差異(P<0.01)，綜上可知東莨菪堿造成小鼠記憶獲得障礙模型最佳時間范圍為給藥后24 h之內(nèi)。

2.1.2乙醇對小鼠記憶再現(xiàn)過程的影響：6 h后第一次測試未給小鼠乙醇灌胃，由圖1,2可知，小鼠避暗錯誤次數(shù)和避暗潛伏期時間與空白組無差異，24 h后即在下次測試之前15 min給小鼠灌服乙醇，可見小鼠避暗錯誤次數(shù)明顯增多(P<0.01)，小鼠避暗潛伏期時間明顯縮短，與空白組相比有明顯差異(P<0.05)；30 h和48 h后，小鼠避暗錯誤次數(shù)和避暗潛伏期時間與空白組相比均無差異，從圖3可見，48 h后探頭次數(shù)仍然明顯增多(P<0.01)。綜上可知乙醇造成小鼠記憶再現(xiàn)障礙模型的最佳時間為下次測試前15 min，乙醇造成小鼠記憶獲得障礙模型最佳時間范圍為給藥后6 h之內(nèi)。

2.1.3亞硝酸鈉對小鼠記憶鞏固過程的影響：由圖1,2可知，與空白組相比，給予亞硝酸鈉后6 h、24 h，小鼠避暗錯誤次數(shù)和避暗潛伏期無明顯變化(P>0.05)。30 h、48 h后小鼠避暗錯誤次數(shù)明顯增多(P<0.05)， 同時小鼠避暗潛伏期時間明顯縮短(P<0.01)。從圖3可見，給予亞硝酸鈉48 h后小鼠將頭部和前爪探入暗箱的次數(shù)(簡稱探頭次數(shù))明顯增加(P<0.01)，綜上可知亞硝酸鈉造成小鼠記憶鞏固障礙模型最佳時間范圍為給藥30 h后進行測試。

圖1 3種藥物在不同時間點對小鼠避暗潛伏期的影響注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01Fig.1 Effects of three drugs on dark latencyin mice at different time pointsNote: compared with the blank group, *P<0.05，**P<0.01

圖2 3種不同藥物對小鼠避暗錯誤次數(shù)的影響注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01Fig.2 Effects of three different drugs on the numberof dark avoidance errors in miceNote: compared with the blank group, *P<0.05，**P<0.01

圖3 3種藥物不同時間對小鼠探頭次數(shù)的影響注：與空白組相比，**P<0.01Fig.3 Effects of the three drugs on the numberof probes in mice at different timesNote: compared with the blank group, **P<0.01

2.2 Morris水迷宮實驗結(jié)果

2.2.1定位航行實驗結(jié)果： 由圖4可知，與空白對照組比較，隨著時間的延長，東莨菪堿模型組小鼠每日定航實驗中逃避潛伏期均顯著延長(P<0.05或P<0.01)，乙醇模型組小鼠逃避潛伏期也延長，但無明顯差異。由圖5可知，東莨菪堿模型組小鼠每日定航實驗中總路程仍明顯增多(P<0.05或P<0.01)，乙醇模型組與空白組相比無明顯差異。

2.2.2主動探索實驗結(jié)果：訓(xùn)練結(jié)束后，第5 d為主動探索實驗，撤去平臺，選擇平臺所在象限對角象限作為入水點，記錄90 s內(nèi)大鼠的穿臺次數(shù)。由圖6可見，東莨菪堿模型組穿越平臺的次數(shù)較空白組明顯減少(P<0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。乙醇模型組與空白對照組相比無明顯變化。

圖4 東莨菪堿模型和乙醇模型小鼠逃避潛伏期時間比較注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01Fig.4 comparison of escape latency between scopolaminemodel and ethanol model miceNote: compared with the blank group, *P<0.05，**P<0.01

圖5 東莨菪堿模型和乙醇模型小鼠定位航行總路程比較注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01Fig.5 Comparison of the total voyage distance ofscopolamine model and ethanol model miceNote: compared with the blank group, *P<0.05，**P<0.01

圖6 東莨菪堿模型和乙醇模型小鼠主動探索次數(shù)比較注：與空白組相比，*P<0.05Fig.6 Comparison of times of active exploration betweenscopolamine model and ethanol model miceNote: compared with the blank group, *P<0.05

3 討論

老年性癡呆又稱阿爾茨海默病(AD)，是一種中老年人群中易發(fā)生的神經(jīng)精神退行性疾病，早期病情表現(xiàn)為記憶力減退、記憶障礙等，此階段是老年癡呆最佳的治療階段，通過改善記憶功能，可有效預(yù)防老年癡呆的發(fā)生，延緩病情發(fā)展及降低病情嚴重程度。因此為了研究治療AD的藥物，動物行為學(xué)實驗和學(xué)習(xí)記憶障礙動物模型應(yīng)運而生[4-5]。在動物行為學(xué)實驗中，學(xué)習(xí)記憶障礙模型的成功建立變得尤為重要。目前關(guān)于建立記憶損傷模型方法較多，但常見的造模方法就是水迷宮和避暗實驗。在各種文獻中制造記憶障礙模型所選藥物種類、給藥時間和劑量比較雜亂，差異較大，為了給后續(xù)研究者提供一個可行的學(xué)習(xí)記憶損傷模型造模方法，我們開展了此項研究。

學(xué)習(xí)記憶是人類和動物賴以生存所不可或缺的重要腦功能之一。學(xué)習(xí)是神經(jīng)系統(tǒng)接受外界環(huán)境變化獲得新行為、經(jīng)驗的過程，記憶是學(xué)習(xí)后經(jīng)驗的保持和再現(xiàn)，因此學(xué)習(xí)和記憶是兩個相互有聯(lián)系的神經(jīng)過程，有賴于全腦功能的整合。一般均把記憶分為3個階段，即獲得、鞏固和再現(xiàn)[6]。針對記憶的這幾個不同階段，我們選擇了不同的損傷藥物：東莨菪堿損傷小鼠記憶獲得過程，亞硝酸鈉損傷小鼠記憶鞏固過程，乙醇影響小鼠記憶再現(xiàn)過程。本文以訓(xùn)練前給藥測定學(xué)習(xí)和記憶獲得的過程；訓(xùn)練后給藥，測試記憶的鞏固過程；測驗前給藥，測定記憶的再現(xiàn)過程。

避暗實驗是最為常用的動物學(xué)習(xí)記憶實驗方法，是利用鼠類嗜暗習(xí)性而設(shè)計，屬于被動回避性條件反射。小鼠受到電擊后立即逃避到安全部位，在5 min內(nèi)經(jīng)多次電擊，小鼠形成記憶，記錄后測驗不同時間點5 min內(nèi)小鼠受到電擊的次數(shù)(錯誤次數(shù))以及首次犯錯誤的時間(逃避潛伏期)[7]。本實驗中通過給小鼠腹腔注射東莨菪堿(1 mg/kg)和35%濃度乙醇灌胃(0.1 mL/10 g)和皮下注射亞硝酸鈉(90 mg/kg)可以成功構(gòu)建小鼠記憶獲得、鞏固、再現(xiàn)幾種學(xué)習(xí)記憶障礙模型，并統(tǒng)計了各種學(xué)習(xí)記憶障礙模型持續(xù)的時間范圍和給予造模藥物的合適時間。從實驗結(jié)果可知東莨菪堿造成學(xué)習(xí)記憶獲得障礙最佳時間范圍為24 h之內(nèi)，乙醇造成小鼠記憶再現(xiàn)障礙維持時間為給予乙醇灌胃后6 h以內(nèi)，亞硝酸鈉造成記憶鞏固障礙模型顯示在電擊訓(xùn)練之后30 h。因此可根據(jù)實驗的需求合理選擇造模藥物和給藥時間，觀察指標以避暗潛伏期、錯誤次數(shù)和探頭次數(shù)為宜。

Morris水迷宮是一種經(jīng)典的學(xué)習(xí)記憶功能評價方法，定航實驗和探索實驗分別反映了動物的空間學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力。本實驗的定位航行和主動探索實驗結(jié)果顯示：東莨菪堿小鼠模型組定位航行逃避潛伏期明顯延長而主動探索穿越平臺的次數(shù)明顯減少(p<0.01或p<0.05)，乙醇模型組無明顯差異(p>0.05)。提示東莨菪堿能夠造成空間學(xué)習(xí)記憶障礙模型，而乙醇組不能作為空間學(xué)習(xí)記憶障礙模型的造模藥物。

綜上所述，本文綜合比較了三種不同藥物建立的學(xué)習(xí)記憶障礙模型，對其形成記憶損傷的持續(xù)時間和用藥劑量進行摸索和比較，成功建立了有效的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型，在恰當?shù)臅r間進行藥物干預(yù)，從而更好地評價改善學(xué)習(xí)記憶障礙新藥的效果，為新藥的臨床前實驗研究提供參考。