朱亞玲,趙洪波,蔣保三,王 剛,張?jiān)矫?刁 勇*

(1.華僑大學(xué)醫(yī)學(xué)院,中國福建泉州362021;2.昆明醫(yī)科大學(xué)分子臨床醫(yī)學(xué)研究院暨云南省干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國云南昆明650500)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常見的惡性腫瘤之一,占原發(fā)性肝癌的70%～90%,是全球范圍內(nèi)致死率排名第二的惡性腫瘤[1]。遺傳因素[2]和環(huán)境因素(酒精、黃曲霉毒素[3]、慢性乙型肝炎病毒[4]等)被認(rèn)為是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展的主要原因[5～6]。雖然診斷技術(shù)、外科治療、化療和分子靶向治療技術(shù)有所改善,但由于肝細(xì)胞癌患者被診斷時(shí)多為中晚期,因此患者的5年生存率仍不盡如人意[7～8]。

肝細(xì)胞癌的發(fā)生是一個(gè)多基因參與、多因子協(xié)調(diào)的復(fù)雜的生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn),血管生成功能失調(diào)、慢性炎癥、內(nèi)分泌激素、脂肪因子和細(xì)胞代謝的改變均可能參與腫瘤的形成過程[9]。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些肝細(xì)胞癌相關(guān)的重要驅(qū)動(dòng)基因,但其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚,臨床上仍然缺乏與患者預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物[10～11]。因此,深入研究肝細(xì)胞癌發(fā)病及進(jìn)展過程潛在的生物學(xué)機(jī)制,對(duì)于開發(fā)新的診斷標(biāo)志物和治療策略具有重要的意義。

近年來,高通量基因芯片和測(cè)序技術(shù)作為基因表達(dá)分析的工具,已被廣泛用于識(shí)別腫瘤發(fā)生過程中遺傳信息的改變,為研究肝細(xì)胞癌基因表達(dá)情況及發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因的變化規(guī)律提供了基礎(chǔ)[12]。本研究利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene Expression O-mnibus,GEO)中肝細(xì)胞癌組織和非癌組織的基因表達(dá)陣列數(shù)據(jù)篩選肝細(xì)胞癌相關(guān)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,同時(shí)結(jié)合KM plotter(Kaplan Meier plotter)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)后分析,以期為揭示肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制和探索肝細(xì)胞癌診斷、治療和預(yù)后相關(guān)的潛在候選生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

數(shù)據(jù)GSE84402[13]從NCBI基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下載得到。該數(shù)據(jù)采用的芯片平臺(tái)是GPL570(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array),包括14例肝細(xì)胞癌組織和14例非癌組織。

1.2 HCC差異表達(dá)基因篩選

采用GEO數(shù)據(jù)庫中基于R語言的網(wǎng)絡(luò)分析工具GEO2R[14](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/geo2r)分析GSE84402中肝細(xì)胞癌組織和非癌組織的差異表達(dá)基因。該工具利用Bioconductor項(xiàng)目中的R語言軟件包GEOquery和Limma,根據(jù)Benjamini和Hochberg提出的假陽性率控制法[15],進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正。差異表達(dá)基因同時(shí)滿足以下條件:FDR(false discovery rate)＜0.05,|log2FC|＞1。

1.3 差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析

生物學(xué)信息注釋及可視化數(shù)據(jù)庫(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID)是基因功能分析的在線生物信息學(xué)工具,可對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)富集分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析。將差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)[16],以 FDR＜0.05為顯著性基因富集的臨界值,對(duì)差異顯著的基因進(jìn)行功能注釋,并分析其參與的生物學(xué)過程及通路。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析及hub genes的篩選

蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫STRING(https://string-db.org/)可利用已知或預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)[17]。將差異基因?qū)隨TRING 10.5分析工具,將最低互作分值(minimum required interaction score)設(shè)置成最高可信(highest confidence 0.9),刪除與其他蛋白質(zhì)無相互作用的節(jié)點(diǎn)后,分析差異基因所編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用。將互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件[18],計(jì)算節(jié)點(diǎn)的度(degree),列出degree排名前20位的中心節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì),并與GO和KEGG富集分析得到的顯著性基因取交集,得到的基因即為核心基因(hub genes)。

1.5 Hub genes與預(yù)后的相關(guān)性分析

KM plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/)從GEO、EGA及TCGA數(shù)據(jù)庫下載基因表達(dá)數(shù)據(jù)、無復(fù)發(fā)和總生存信息,利用集成基因表達(dá)和臨床數(shù)據(jù)的PostgreSQL服務(wù)器對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,依據(jù)所提出的生物標(biāo)志物的不同分位數(shù)表達(dá)式將患者樣本分成兩組[19]。本研究根據(jù)hub genes的表達(dá)水平,以中位數(shù)值將KM plotter數(shù)據(jù)庫中納入的364例肝癌患者分成高表達(dá)組和低表達(dá)組,分析兩組患者預(yù)后的相關(guān)性。通過Kaplan Meier生存圖比較兩組病人隊(duì)列,計(jì)算危險(xiǎn)比(hazard radio,HR)及95%置信區(qū)間(confidence interval,CI),差異比較用logrank P檢驗(yàn),logrank P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

通過對(duì)肝細(xì)胞癌組織和非癌組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,共篩選出1 307個(gè)表達(dá)差異明顯的基因,其中上調(diào)基因741個(gè),下調(diào)基因566個(gè)。排名前10的差異表達(dá)基因見表1。

2.2 差異表達(dá)基因的GO富集分析結(jié)果

采用DAVID 6.8對(duì)741個(gè)上調(diào)基因和566個(gè)下調(diào)基因進(jìn)行GO生物學(xué)過程富集分析。上調(diào)基因主要富集到細(xì)胞分裂、姐妹染色單體黏著和分離、有絲分裂核分裂、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期等25個(gè)生物學(xué)過程;下調(diào)基因主要涉及氧化還原、急性期反應(yīng)、環(huán)氧酶P450通路、異源代謝過程、藥物代謝過程等23個(gè)生物學(xué)過程。上、下調(diào)基因前5位的生物學(xué)過程富集見表2。

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析結(jié)果

采用DAVID 6.8對(duì)741個(gè)上調(diào)基因和566個(gè)下調(diào)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。上調(diào)基因中有2條富集通路呈顯著性(FDR＜0.05),下調(diào)基因中有10條富集通路呈顯著性(FDR＜0.05)。上調(diào)基因主要涉及細(xì)胞周期和DNA復(fù)制信號(hào)通路,下調(diào)基因主要涉及代謝途徑、補(bǔ)體途徑、視黃醇代謝、化學(xué)物致癌作用、膽汁分泌、脂肪酸降解等。上調(diào)及下調(diào)基因前5位的顯著富集通路見表3。

2.4 差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析及hub genes的篩選

通過STRING 10.5及Cytoscape 3.6.1軟件分析,得到包含567個(gè)差異表達(dá)基因及3 095條互作關(guān)系的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖1)。結(jié)果顯示最大degree值為107。Degree值排名前20位的中心節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)見表4。將編碼前20位中心節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)的差異基因與GO和KEGG富集得到的顯著性基因取交集,得到BUB1 (mitotic checkpoint serine/threonine kinase,絲裂原檢查點(diǎn)絲氨酸/蘇氨酸激酶)、BUB1B(mitotic checkpoint serine/threonine kinase B,絲裂原檢查點(diǎn)絲氨酸/蘇氨酸激酶B)、CCNA2(cyclin A2,細(xì)胞周期蛋白A2)、CCNB1(cyclin B1,細(xì)胞周期蛋白 B1)、CCNB2(cyclin B2,細(xì)胞周期蛋白 B2)、CDC20(cell division cycle 20,細(xì)胞分裂周期蛋白20)、CDK1(cyclin-dependent kinase 1,周期蛋白依賴激酶1)、MAD2L1(mitotic arrest deficient 2 like 1)、PLK1(Polo-like kinase 1,Polo樣激酶1)等9個(gè)hub genes,其相互作用網(wǎng)絡(luò)包括36條互作關(guān)系(圖2A)。KEGG分析發(fā)現(xiàn)hub genes主要富集在細(xì)胞周期等通路(圖2B)。

表2 前5位差異表達(dá)基因的生物學(xué)過程富集Table 2 Biological process enrichment results of DEGs(Top 5)

表3 前5位差異表達(dá)基因的KEGG通路富集Table 3 KEGG pathway analysis of DEGs(Top 5)

2.5 Hub genes與預(yù)后的相關(guān)性

利用KM plotter數(shù)據(jù)庫中納入的364例肝癌患者的基因表達(dá)及臨床數(shù)據(jù),對(duì)hub genes進(jìn)行總生存期的分析,相關(guān)數(shù)據(jù)如下:BUB1(HR=1.85;95%CI=1.3～2.64;logrank P=0.000 52),BUB1B(HR=1.82;95%CI=1.28～2.59;logrank P=0.000 71),CC-NA2(HR=1.69;95%CI=1.19～2.4;logrank P=0.002 9),CCNB1(HR=1.92;95%CI=1.34～2.74;log-rank P=0.000 26),CCNB2(HR=1.62;95%CI=1.14～2.29;logrank P=0.006 7),CDC20(HR=2.3;95%CI=1.6～3.3;logrank P=3.4E-06),CDK1(HR=1.69;95%CI=1.19～2.4;logrank P=0.002 9),MAD2L1(HR=1.88;95%CI=1.33～2.68;logrank P=0.000 33),PLK1(HR=1.89;95%CI=1.33～2.71;logrank P=0.000 36),以上結(jié)果顯示9個(gè)hub genes在肝癌患者中的表達(dá)均上調(diào),各基因logrank P＜0.05,說明hub genes高表達(dá)組與低表達(dá)組肝癌患者生存期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示hub genes的高表達(dá)與肝癌患者預(yù)后不良相關(guān)(圖 3)。

表4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中排名前20的中心節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)Table 4 The central node proteins in the PPI network(Top 20)

圖1 差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)紅色節(jié)點(diǎn)為表達(dá)上調(diào)的基因,綠色節(jié)點(diǎn)為表達(dá)下調(diào)的基因。Fig.1 PPI network of DEGsRed nodes denote up-regulated genes,while green nodes denote down-regulated genes.

圖2 Hub genes分析(A)Hub genes的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò);(B)Hub genes的KEGG通路分析。Fig.2 Result analysis of hub genes(A)PPI network of hub genes;(B)KEGG pathway analysis of hub genes.

3 討論

肝細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)常見惡性腫瘤之一,每年全世界約有778 000例新發(fā)病例和745 000例死亡病例,其中僅中國就占一半[1]。雖然肝細(xì)胞癌的診斷和治療技術(shù)取得了顯著進(jìn)展,但因其具有浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特性,最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后仍然較差。

圖3 Hub genes的總生存期分析HR:危險(xiǎn)比;Logrank P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。紅色曲線表示高表達(dá)組,黑色曲線代表低表達(dá)組。Fig.3 Analysis of effects of hub genes on overall survivalHR:Hazard radio;Logrank P＜0.05 stands for significant difference.Black and red lines represent low and high expression groups,respectively.

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫檢索包含肝細(xì)胞癌組織和非癌組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE84402,利用生物信息學(xué)工具進(jìn)行深入挖掘分析,共篩選出1 307個(gè)差異表達(dá)基因。通過GO分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要參與了有絲分裂、細(xì)胞周期、DNA復(fù)制及物質(zhì)代謝等生物學(xué)過程。KEGG通路分析顯示差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞周期、DNA復(fù)制及物質(zhì)代謝等通路。通路分析結(jié)果與GO富集分析結(jié)果一致,表明細(xì)胞周期、DNA復(fù)制及物質(zhì)代謝等功能的異常,在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要作用。進(jìn)一步篩選出BUB1、BUB1B、CCNA2、CCNB1、CCNB2、CDC20、CDK1、MAD2L1、PLK1 等9個(gè)hub genes,分析發(fā)現(xiàn)9個(gè)hub genes均與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)。有研究表明細(xì)胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),且多是由于編碼蛋白質(zhì)的上游信號(hào)通路的突變或基因損傷所致[20]。采用KM plotter數(shù)據(jù)庫對(duì)hub genes進(jìn)行總生存期的分析,結(jié)果顯示9個(gè)hub genes在肝細(xì)胞癌患者中均為高表達(dá)基因,且與肝細(xì)胞癌的預(yù)后顯著相關(guān)。

BUB1基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸激酶參與細(xì)胞有絲分裂過程[21],其表達(dá)增加可改變有絲分裂紡錘體組裝檢查點(diǎn)通路,在細(xì)胞增殖和腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用[22]。Xu等[23]研究發(fā)現(xiàn),miR-490-5p可通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞TGFβ/Smad通路,抑制BUB1表達(dá),從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、浸潤和遷移能力,進(jìn)一步降低細(xì)胞存活率并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。BUB1B基因定位于15號(hào)染色體的15q15.1區(qū),BUB1B蛋白是一種具有紡錘體分離調(diào)控功能的蛋白激酶[24]。大量研究表明BUB1B參與了多種腫瘤形成過程[25～28],但其在肝癌中的作用機(jī)制鮮有報(bào)道,仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。CCNA2在細(xì)胞有絲分裂的S/G2期高水平表達(dá),CCNA2異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[29]。Hung等[30]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中精氨琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase,ASL)與CCNA2相互作用,并通過非酶途徑促進(jìn)肝癌的形成。CCNB1可促進(jìn)細(xì)胞從G2期向M期轉(zhuǎn)變,但在腫瘤細(xì)胞中CCNB1過度表達(dá),并與CDK1結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖[31]。Chai等[32]發(fā)現(xiàn)沉默肝癌細(xì)胞的FOXM1基因可顯著降低CCNB1的表達(dá)水平,表明CCNB1在FOXM1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖中有重要作用,證明FOXM1-CCNB1與肝癌患者預(yù)后不良相關(guān)。CCNB2在多種腫瘤組織中過表達(dá),且與腫瘤的侵襲和臨床治療效果差相關(guān),肝癌細(xì)胞中KPNA2可通過促進(jìn)CCNB2/CDK1的表達(dá),誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖,且與肝癌患者總生存時(shí)間和無病生存時(shí)間顯著降低有關(guān)[33]。CDC20編碼與細(xì)胞周期的APC/C相互作用的調(diào)節(jié)蛋白,肝細(xì)胞中CDC20高表達(dá)可加速細(xì)胞增殖,促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展,但其分子機(jī)制及預(yù)后意義有待深入研究[34]。CDK1是細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)因子[35～36]。研究表明:肝細(xì)胞癌組織的CDK1表達(dá)水平明顯高于非癌組織,CDK1在凋亡蛋白誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡中起著重要的調(diào)控作用[37];CDK1的高表達(dá)與肝癌患者整體存活率低有關(guān),利用CDK1抑制劑阻斷CDK1/pdk1/β-Cat信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),可提高索拉菲尼治療肝癌臨床前模型的療效,為臨床提出個(gè)性化治療方案提供依據(jù)[38]。MAD2L1被認(rèn)為是染色體控制通路的重要介質(zhì),MDA2L1表達(dá)水平異?？蓪?dǎo)致染色體不穩(wěn)定,并促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展,其在肝癌中的表達(dá)水平與腫瘤的大小、分期和分級(jí)密切相關(guān)[39]。Li等[40]報(bào)道MDA2L1在肝癌組織和細(xì)胞中高表達(dá),miR-200c-5p可通過下調(diào)MAD2L1的表達(dá),抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和浸潤,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PLK1被認(rèn)為是肝癌中的一個(gè)重要致癌因子[41],其在調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂、胞質(zhì)分裂、DNA損傷應(yīng)答等細(xì)胞周期過程中發(fā)揮重要作用[42～43]。研究發(fā)現(xiàn)抑制PLK1表達(dá),可抑制肝癌細(xì)胞增殖[44];PLK1可作為肝癌的預(yù)后標(biāo)志物與治療靶點(diǎn),但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明[45～46]。

綜上所述,本研究利用生物信息學(xué)的方法對(duì)肝細(xì)胞癌的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘和分析,得到了1 307個(gè)差異表達(dá)基因,其中BUB1、BUB1B、CCNA2、CCNB1、CCNB2、CDC20、CDK1、MAD2L1和PLK1等9個(gè)hub genes經(jīng)總生存期分析發(fā)現(xiàn)與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良有關(guān),該結(jié)果為揭示肝細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制,篩選有效的診斷和預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物及藥物治療靶點(diǎn)提供了參考。