陶鵬飛,姚晨赫,孫雅煊,孟欣怡,黃漢昌

(北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)北京100191)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以神經(jīng)元丟失和腦萎縮為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)退行性疾病,其臨床表現(xiàn)為記憶丟失、語(yǔ)言水平下降和行動(dòng)能力受損[1～3]。AD主要的神經(jīng)病理學(xué)特征之一是腦細(xì)胞外出現(xiàn)被稱為老年斑(senile plaque,SP)的淀粉樣斑塊,其主要成分為β-淀粉樣蛋白(amyloid βprotein,Aβ)。Aβ由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)經(jīng)β-裂解途徑產(chǎn)生。AD確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前,被廣泛認(rèn)同的“淀粉樣級(jí)聯(lián)假說(shuō)”認(rèn)為,大腦中Aβ異常聚集導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變,最后引發(fā)神經(jīng)元的死亡。

APP的編碼基因位于人類第21號(hào)染色體長(zhǎng)臂(21q21.3),至少由18個(gè)外顯子和17個(gè)內(nèi)含子組成。該基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯后因剪切方式的不同,可形成至少8種長(zhǎng)度不等的APP異構(gòu)體,其中以APP695、APP751和 APP770較為常見,APP695主要表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞[4～5]。細(xì)胞膜上的APP目前被認(rèn)為主要經(jīng)兩種途徑裂解。一方面,在細(xì)胞膜上的APP主要被α-分泌酶剪切,剪切位點(diǎn)為APP695序列的第612、613個(gè)氨基酸殘基(對(duì)應(yīng)APP770序列的第687、688個(gè)氨基酸殘基)之間,產(chǎn)生可溶性的N端碎片sAPPα并釋放到細(xì)胞外,同時(shí)產(chǎn)生C端碎片CTFα(又稱C83)綁定于細(xì)胞膜上,隨后CTFα被γ-分泌酶剪切,生成Aβ17-40或Aβ17-42,以及胞內(nèi)域片段AICD[6～7]。由于γ-分泌酶剪切位點(diǎn)位于Aβ氨基酸殘基之間,因此沒(méi)有Aβ的生成,這一剪切途徑被稱為非淀粉樣途徑[8～10]。另一方面,細(xì)胞膜上的部分APP通過(guò)依賴網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用迅速內(nèi)化,并被運(yùn)輸?shù)胶藘?nèi)體(endosome)或者反式高爾基體。在此,APP首先被β-分泌酶在APP695序列的第596、597個(gè)氨基酸殘基(對(duì)應(yīng)APP770序列的第671、672個(gè)氨基酸殘基)之間剪切,產(chǎn)生N端片段sAPPβ和C端片段CTFβ(又稱C99),隨后CTFβ 被 γ-分泌酶剪切,生成 Aβ1-40或 Aβ1-42,以及胞內(nèi)域片段AICD,此過(guò)程被稱為淀粉樣途徑[5,11～13]。

有研究表明,Aβ異常聚集可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NFT)的形成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等,隨后引發(fā)神經(jīng)元丟失[10,14]。值得注意的是,內(nèi)源性Aβ片段的生成也伴隨著sAPPβ、AICD片段的產(chǎn)生。本研究利用慢病毒介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染的方法,分別構(gòu)建了過(guò)表達(dá)sAPPβ、Aβ和AICD片段的 SH-SY5Y細(xì)胞系,并考察了其對(duì)細(xì)胞氧化損傷和線粒體膜電位去極化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

過(guò)表達(dá)sAPPβ、Aβ和AICD片段的SH-SY5Y神經(jīng)瘤細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建。將表達(dá)sAPPβ、Aβ和AICD蛋白片段(分別為APP蛋白的18～596、597～638和639～695氨基酸殘基)的基因編碼序列構(gòu)建到質(zhì)粒表達(dá)載體pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A中,包裝成慢病毒顆粒。

High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;TRIzol?Reagent試劑盒購(gòu)于美國(guó)Ambion公司;抗sAPPβ抗體(A8967)購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司;抗AICD抗體(A8717)購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司;抗Aβ抗體(Ab2539)購(gòu)于英國(guó)Abcam公司;抗β-actin抗體(A1978)購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司;細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)購(gòu)于日本Dojindo公司;乳酸脫氫酶 (lactate dehy drogenase,LDH)測(cè)定試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司;活性氧檢測(cè)試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)購(gòu)于美國(guó)Genview公司;辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(IH-0011)購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;辣根酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(IH-0011)購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;新霉素(G418)購(gòu)于美國(guó)Genview公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞均勻接種于培養(yǎng)皿中,加入5 mL含血清和雙抗的培養(yǎng)基[basal medium/DMEM/F 12(1︰1)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%鏈霉素-青霉素溶液]。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,3～4 d傳代1次。將SH-SY5Y細(xì)胞按1×105個(gè)/孔均勻接種于6孔板中,24 h后將培養(yǎng)液換成不含雙抗的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取其中一孔計(jì)數(shù),按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=5,分別將攜帶目的基因sAPPβ、Aβ和AICD質(zhì)粒的慢病毒顆粒以及不含目的基因的空質(zhì)粒慢病毒顆粒加入細(xì)胞培養(yǎng)液。將細(xì)胞分為5組:1)空白對(duì)照組,即正常SH-SY5Y細(xì)胞;2)sAPPβ細(xì)胞組,即過(guò)表達(dá)sAPPβ片段的SH-SY5Y細(xì)胞;3)Aβ細(xì)胞組,即過(guò)表達(dá)Aβ片段的SH-SY5Y細(xì)胞;4)AICD細(xì)胞組,即過(guò)表達(dá)AICD片段的SH-SY5Y細(xì)胞;5)陰性對(duì)照組,即表達(dá)空質(zhì)粒的SH-SY5Y細(xì)胞。

1.2.2 新霉素篩選轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和細(xì)胞熒光蛋白的表達(dá)

質(zhì)粒載體包含熒光蛋白表達(dá)基因EGFP和新霉素(G418)抗性基因。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,加入含5%G418的篩選培養(yǎng)基,成功篩選的細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于熒光顯微鏡下,曝光時(shí)間1 ms拍攝明場(chǎng)照,曝光時(shí)間200 ms拍攝熒光照。

1.2.3 RT-PCR分析目的基因的mRNA表達(dá)

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的5組SH-SY5Y細(xì)胞分別以2×105個(gè)/孔接種于Φ3 cm培養(yǎng)皿中,24 h后采用TRI-zol?Reagent試劑盒提取細(xì)胞總RNA。利用酶標(biāo)儀在260/280 nm下測(cè)定總RNA吸光度(260/280 nm吸光度比值在1.6～1.8)。將總RNA通過(guò)High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction,RT-PCR)擴(kuò)增cDNA,主要參數(shù)如下:5℃變性15 min;3步循環(huán),即95℃ 15 s、54℃30 s、72℃45 s,循環(huán)數(shù)為40。目的基因引物如表1所示。

1.2.4 Western-blot分析目的蛋白片段的表達(dá)情況

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的5組SH-SY5Y細(xì)胞分別以5×105個(gè)/孔接種于Φ3 cm培養(yǎng)皿中,24 h后提取細(xì)胞總蛋白質(zhì),Western-blot檢測(cè)各組細(xì)胞目的蛋白片段的表達(dá)情況。操作方法:細(xì)胞用PBS洗滌兩遍,每個(gè)培養(yǎng)皿加入120 μL含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,4℃下收集細(xì)胞,13 000 g離心15 min。BCA法測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electropheresis,PAGE)分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上;5%脫脂奶粉封閉1 h,4℃下一抗孵育過(guò)夜;經(jīng)TBST緩沖液洗滌后常溫條件下二抗孵育2 h;增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemiluminescence,ECL)測(cè)定蛋白質(zhì)條帶光密度值,并用軟件Quantity One分析條帶灰度值。

1.2.5 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活力

采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活力,CCK-8中的主要成分WST?-8能被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為水溶性的橙黃色甲臜,生成甲臜的量與細(xì)胞數(shù)成正比,可間接測(cè)定活細(xì)胞數(shù)量。將5組SH-SY5Y細(xì)胞以1×104個(gè)/孔分別接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液,置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。于波長(zhǎng)450 nm(參比波長(zhǎng)630 nm)下酶標(biāo)儀測(cè)定OD值,OD值/每孔細(xì)胞數(shù)得到細(xì)胞相對(duì)存活力,單位為OD/104個(gè)細(xì)胞。

1.2.6 乳酸脫氫酶(LDH)活力測(cè)定

將5組SH-SY5Y細(xì)胞分別以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中(細(xì)胞懸液為每孔100 μL),培養(yǎng)24 h,按照LDH測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定培養(yǎng)基中的LDH活力。正常情況下LDH存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時(shí),LDH會(huì)釋放到培養(yǎng)基中,通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH的酶活性可以反映細(xì)胞膜的損傷程度。LDH酶活性測(cè)定原理:LDH可催化NAD+生成NADH,NADH和碘硝基氯化四氮唑藍(lán)(2-p-iodophenyl-3-nitrophyltetrazolium chloride,INT)經(jīng)硫辛酰胺脫氫酶催化反應(yīng)生成NAD+和強(qiáng)生色物甲臢,后者于490 nm波長(zhǎng)處產(chǎn)生吸收峰。實(shí)驗(yàn)中用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值,OD值/每孔細(xì)胞數(shù)得到細(xì)胞LDH相對(duì)活力,單位為OD/104個(gè)細(xì)胞。

1.2.7 細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平測(cè)定

將5組SH-SY5Y細(xì)胞分別以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h,加入無(wú)熒光的二氯二氫熒光素二乙酸酯(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate,DCFH-DA)探針(終濃度為 10 μmol/L)。DCFH-DA可自由穿過(guò)細(xì)胞膜,在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解為DCFH,不能穿過(guò)細(xì)胞膜的DCFH在細(xì)胞內(nèi)被活性氧氧化為有熒光的DCF。DCFH-DA探針?lè)跤?xì)胞20 min后用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,采用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(激發(fā)波長(zhǎng)502 nm,發(fā)射波長(zhǎng)530 nm),OD值/每孔細(xì)胞數(shù)得到細(xì)胞內(nèi)活性氧相對(duì)水平,單位為OD/104個(gè)細(xì)胞。

表1 RT-PCR所用引物序列Table 1 Primers for RT-PCR

1.2.8 線粒體膜電位測(cè)定

將5組SH-SY5Y細(xì)胞分別以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h后吸除培養(yǎng)液,每孔加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)液和100 μL JC-1染色工作液,充分混勻,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃下孵育20 min。吸除上清,用JC-1染色緩沖液洗滌2次,每孔加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)液,采用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。線粒體膜電位較高時(shí),JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物,產(chǎn)生紅色熒光;線粒體膜電位較低時(shí),JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中,此時(shí)JC-1為單體,產(chǎn)生綠色熒光。JC-1單體最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為514 nm/529 nm,聚合體最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為585 nm/590 nm。采用熒光酶標(biāo)儀分別測(cè)定聚合物和單體的OD值,(ODred/ODgreen)/細(xì)胞個(gè)數(shù)表示線粒體膜電位去極化的程度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定均至少重復(fù)3次,采用IBM SPSS Statistics軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P＜0.05視為差異有顯著性。Sigma Plot計(jì)算機(jī)軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)及熒光蛋白表達(dá)

從細(xì)胞EGFP熒光蛋白的表達(dá)可以看出,空白對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞無(wú)明顯熒光(極微弱的熒光可視為細(xì)胞自發(fā)熒光),而轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均可見熒光(圖1 a～e),初步表明質(zhì)?；蚪M已成功整合到宿主細(xì)胞,并表達(dá)了熒光蛋白。與空白對(duì)照組SH-SY5Y 細(xì)胞(圖 1A)相比,Aβ 組(圖 1C)和 AICD組(圖1D)的細(xì)胞突觸變短,胞體收縮,初步表明轉(zhuǎn)染Aβ或AICD基因后,SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)受到一定的影響。

2.2 RT-PCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)

目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞后是否表達(dá),首先要確定目的基因是否能轉(zhuǎn)錄為mRNA。在RT-PCR的結(jié)果處理中,將循環(huán)閾值設(shè)為0.1,得到各組細(xì)胞Ct值,根據(jù)相對(duì)定量法:目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct,得到各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞目的基因相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如圖2所示,與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞相比,sAPPβ、Aβ和AICD組細(xì)胞中目的基因相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P＜0.05),表明轉(zhuǎn)染sAPPβ、Aβ和AICD基因的細(xì)胞成功過(guò)表達(dá)了sAPPβ、Aβ和AICD基因,這在mRNA水平上確定了目的基因已成功導(dǎo)入宿主細(xì)胞,并能夠轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA。

圖1 細(xì)胞形態(tài)及熒光圖(A)空白對(duì)照組細(xì)胞明場(chǎng)圖;(a)空白對(duì)照組細(xì)胞熒光圖;(B)sAPPβ細(xì)胞組明場(chǎng)圖;(b)sAPPβ細(xì)胞組熒光圖;(C)Aβ細(xì)胞組明場(chǎng)圖;(c)Aβ細(xì)胞組熒光圖;(D)AICD細(xì)胞組明場(chǎng)圖;(d)AICD細(xì)胞組熒光圖;(E)陰性對(duì)照組細(xì)胞明場(chǎng)圖;(e)陰性對(duì)照組細(xì)胞熒光圖。Fig.1 Morphological and fluorescence images of cells in each group(A)White light of control group;(a)Fluorescence of control group;(B)White light of sAPPβ group;(b)Fluorescence of sAPPβ group;(C)White light of Aβ group;(c)Fluorescence of Aβ group;(D)White light of AICD group;(d)Fluorescence of AICD group;(E)White light of negative control group;(e)Fluorescence of negative control group.

2.3 Western-blot分析目的蛋白片段的表達(dá)情況

進(jìn)一步在翻譯水平研究目的基因的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示,與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞相比,分別轉(zhuǎn)染sAPPβ、Aβ和AICD基因的細(xì)胞中sAPPβ、Aβ和AICD蛋白片段的表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05),表明轉(zhuǎn)染sAPPβ基因的細(xì)胞過(guò)表達(dá)了sAPPβ蛋白片段,轉(zhuǎn)染Aβ基因的細(xì)胞過(guò)表達(dá)了Aβ蛋白片段,轉(zhuǎn)染AICD基因的細(xì)胞過(guò)表達(dá)了AICD蛋白片段。

2.4 過(guò)表達(dá) sAPPβ、Aβ和 AICD基因?qū)?SHSY5Y細(xì)胞存活力的影響

為了研究APP的β裂解片段sAPPβ、Aβ和AICD對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,本研究進(jìn)一步考察了轉(zhuǎn)染目的基因后細(xì)胞的存活力。結(jié)果如圖4所示,與空白對(duì)照組細(xì)胞相比,陰性對(duì)照組細(xì)胞的存活力無(wú)顯著差異,表明載體基因組轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞基因組后,宿主細(xì)胞的相對(duì)存活力不受影響;與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染sAPPβ、Aβ和AICD基因后細(xì)胞的相對(duì)存活力均顯著下降(P＜0.05)。以上結(jié)果表明過(guò)表達(dá) sAPPβ、Aβ或AICD基因后,SH-SY5Y細(xì)胞的存活力在一定程度上會(huì)降低。

2.5 過(guò)表達(dá) sAPPβ、Aβ和 AICD基因?qū)?SHSY5Y細(xì)胞膜損傷的影響

圖2 目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平(n=3)*:與空白對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.05);#:與陰性對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.05)。Fig.2 The relative expression levels of transfected target genes(n=3)*:Compared with control group,the difference is significant(P＜0.05);#:Compared with negative control group,the difference is significant(P＜0.05).

圖3 sAPPβ、Aβ和AICD蛋白片段的相對(duì)表達(dá)量(n=3)*:與空白對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.05);#:與陰性對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.05)。Fig.3 The relative expression levels of sAPPβ,Aβ and AICD fragments(n=3)*:Compared with control group,the difference is significant(P＜0.05);#:Compared with negative control group,the difference is significant(P＜0.05).

圖4 細(xì)胞相對(duì)存活力(n=7)*:與空白對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.05);#:與陰性對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.05)。Fig.4 The relative cell viability(n=7)*:Compared with control group,the difference is significant(P＜0.05);#:Compared with negative control group,the difference is significant(P＜0.05).

圖5 細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH相對(duì)活性(n=7)*:與空白對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.05);#:與陰性對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.05)。Fig.5 The relative level of LDH in culture medium(n=7)*:Compared with control group,the difference is significant(P＜0.05);#:Compared with negative control group,the difference is significant(P＜0.05).

細(xì)胞膜的完整程度與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞損傷密切相關(guān),本研究通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性,定量分析sAPPβ、Aβ和AICD片段對(duì)細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果如圖5所示,與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組培養(yǎng)液中LDH活力上升(P＜0.05),表明載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞基因組后,宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜受到一定程度的損傷。此外,與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染sAPPβ基因的細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力均沒(méi)有顯著差異,而轉(zhuǎn)染Aβ和AICD基因的細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力均顯著提高(P＜0.05)。以上結(jié)果表明,sAPPβ片段不會(huì)對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生明顯損傷,而Aβ和AICD片段則會(huì)造成細(xì)胞膜的顯著損傷。

2.6 過(guò)表達(dá) sAPPβ、Aβ和 AICD基因?qū)?SHSY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

活性氧包括超氧自由基、過(guò)氧化氫及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物和羥化物,參與包括細(xì)胞增殖、發(fā)育、衰老和凋亡在內(nèi)的許多生理和病理過(guò)程。本研究中各組細(xì)胞的胞內(nèi)ROS水平測(cè)定結(jié)果如圖6所示,與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)ROS的活性無(wú)顯著差異,表明載體基因組整合到宿主細(xì)胞基因組后,胞內(nèi)ROS的水平不受影響。但是,與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞相比,Aβ和AICD基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)ROS的水平均顯著上升(P＜0.05),這說(shuō)明過(guò)表達(dá)Aβ和AICD片段會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS活性上升,引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖6 細(xì)胞中ROS相對(duì)活性(n=6)*:與空白對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.05);#:與陰性對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.05)。Fig.6 The relative activity of intracellular ROS(n=6)*:Compared with control group,the difference is significant(P＜0.05);#:Compared with negative control group,the difference is significant(P＜0.05).

2.7 過(guò)表達(dá) sAPPβ、Aβ和 AICD基因?qū)?SHSY5Y細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。本研究中各組細(xì)胞的線粒體膜電位測(cè)定結(jié)果如圖7所示,與空白對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞相比,陰性對(duì)照組細(xì)胞的胞內(nèi)線粒體膜電位相對(duì)水平無(wú)顯著差異,表明載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后,胞內(nèi)線粒體膜電位水平不受影響。同時(shí),與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染Aβ和AICD基因的細(xì)胞中線粒體膜電位相對(duì)水平均顯著降低 (P＜0.05),這表明過(guò)表達(dá)Aβ和AICD片段能夠引發(fā)細(xì)胞線粒體膜電位的去極化作用。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的方法,成功構(gòu)建了分別過(guò)表達(dá)sAPPβ、Aβ和AICD片段的SH-SY5Y細(xì)胞系。首先,G418篩選和EGFP熒光蛋白的檢測(cè)均證明載體基因組已成功整合到宿主細(xì)胞基因組,并且整合后基因組中的新霉素抗性基因和熒光蛋白基因EGFP均已成功表達(dá);其次,我們從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平證明各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中目的基因成功地進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄和翻譯。

圖7 細(xì)胞線粒體膜電位相對(duì)水平(n=4)*:與空白對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.05);#:與陰性對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.05)。Fig.7 The relative level of mitochondrial membrane potential(n=4)*:Compared with control group,the difference is significant(P＜0.05);#:Compared with negative control group,the difference is significant(P＜0.05).

研究顯示,sAPPβ片段不僅能夠降低原代神經(jīng)元細(xì)胞的黏附作用,促進(jìn)細(xì)胞突觸的增長(zhǎng)[15],而且還能誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞快速分化[16]。因此推測(cè)sAPPβ片段無(wú)細(xì)胞毒性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)sAPPβ片段對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞系的細(xì)胞膜、胞內(nèi)ROS和線粒體膜電位均無(wú)顯著影響,這也表明sAPPβ片段無(wú)細(xì)胞毒性。

已有研究報(bào)道,外源性Aβ1-42通過(guò)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡,并上調(diào)caspase-12和caspase-3等凋亡因子的水平[17]。線粒體膜電位下降與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān),線粒體損傷導(dǎo)致細(xì)胞色素c、caspase-3和bax等促凋亡因子的釋放,進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)效應(yīng),最終引發(fā)細(xì)胞凋亡[18～19]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建過(guò)表達(dá)Aβ片段的SH-SY5Y細(xì)胞模型,在此模型的基礎(chǔ)上證明內(nèi)源性Aβ片段可導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞膜損傷、線粒體去極化、胞內(nèi)ROS升高和細(xì)胞活力降低。

腦啡肽酶(neprilysin,nep)可降解內(nèi)源性Aβ,降低腦內(nèi)Aβ水平,而AICD片段可與nep的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,最終降低nep的表達(dá)與活性[20～21]。前腦和海馬神經(jīng)元過(guò)表達(dá)AICD片段的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示出多種AD病理特征,包括tau蛋白過(guò)度磷酸化、海馬三突觸回路功能異常、記憶功能損傷[22～23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)AICD片段可在一定程度上引起SH-SY5Y細(xì)胞活力下降、細(xì)胞膜受損、胞內(nèi)ROS水平升高和線粒體膜電位發(fā)生去極化。