楊金穎，孫芳芳，崔學(xué)剛，張偉國

(天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 301700)

桂枝紅花顆粒(Ⅰ)是天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，主要用于治療雷諾氏癥、寒冷性多形性紅斑、凍瘡等癥。桂枝紅花顆粒(Ⅰ)主要功效是溫陽祛寒，活血化瘀，由桂枝、當(dāng)歸、紅花等藥物組成。方中桂枝發(fā)散風(fēng)寒，溫助陽氣；當(dāng)歸、紅花辛行溫通，活血通脈，共為君藥。

羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A, HSYA)是紅花中活血化瘀的主要成分，也是最有效的水溶性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[1，2]，羥基紅花黃色素A具有抗腦缺血損傷、抗氧化、抗炎、抗心肌損傷、影響血小板的活性、抗腫瘤等作用。桂枝紅花顆粒(Ⅰ)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定部分空缺，本文采用高效液相色譜法建立羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定方法，以完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。該方法簡便準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津LC-2010CHT高效液相色譜儀，色譜柱：Ultimate C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；BT25S型電子天平 (十萬分之一)；BSA224S型電子天平(萬分之一)。

1.2試藥 羥基紅花黃色素A對(duì)照品(批號(hào)111637-201609，含量以91.9%計(jì))，購自中國食品藥品檢定研究院。桂枝紅花顆粒(Ⅰ)(天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，10 g/袋，批號(hào)20180720、20180721、20180722)。甲醇(色譜純，honeywell)、乙腈(色譜純，honeywell)、磷酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Ultimate C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，檢測(cè)波長為403 nm，柱溫30 ℃，流速：1.0 ml/min，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液(24∶2∶74)，進(jìn)樣量10 μl。理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得儲(chǔ)備液；取7 ml儲(chǔ)備液置25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得1 ml含羥基紅花黃色素A 54.81 μg的對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取桂枝紅花顆粒(Ⅰ)樣品，約2 g，精密稱定，加入25%甲醇50 ml，稱定重量，超聲40 min(超聲時(shí)加入冰袋)，放冷，再稱定重量，加25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性樣品溶液的制備 按處方及工藝制備缺紅花藥材的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3專屬性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液和對(duì)照品溶液在相同位置均有色譜峰存在，而陰性樣品溶液在此位置沒有相應(yīng)的色譜峰，表明在該方法下樣品分離度好，陰性樣品對(duì)測(cè)定無干擾。色譜圖見圖1。

2.4線性關(guān)系考查 稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得儲(chǔ)備液，再分別稀釋制成濃度為5.87、11.74、27.40、54.81、78.30和117.45 μg/ml的溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)分析，以羥基紅花黃色素A的峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得羥基紅花黃色素A回歸方程為Y=32 116X-1 762.5(r=1.000 0)，線性范圍為5.87～117.45 μg/ml。

1.羥基紅花黃色素A圖1 對(duì)照品(A)供試品(B)缺紅花陰性樣品(C)HPLC色譜圖

2.5精密度試驗(yàn) 取桂枝紅花顆粒(Ⅰ)(批號(hào)20180721)，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄羥基紅花黃色素A峰面積，計(jì)算RSD值為0.17 %，表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取桂枝紅花顆粒(Ⅰ)(批號(hào)20180721)，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，精密吸取同一份樣品溶液，分別在0、2、4、8、12和24 h進(jìn)樣，記錄羥基紅花黃色素A峰面積，計(jì)算RSD值為0.35%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7樣品重復(fù)性試驗(yàn) 取桂枝紅花顆粒(Ⅰ)(批號(hào)20180721)6 份，每份約2 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，分別進(jìn)樣，記錄羥基紅花黃色素A峰面積，計(jì)算RSD值為0.79%，表明方法重復(fù)性較好。

2.8加樣回收率試驗(yàn) 取桂枝紅花顆粒(Ⅰ)(批號(hào)20180721)研細(xì)，精密稱取 6 份，每份約1 g，均精密加入一定量的對(duì)照品溶液，分別按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄羥基紅花黃色素A峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果羥基紅花黃色素A的平均回收率為99.88%，RSD為1.41%。見表1。

2.9樣品測(cè)定結(jié)果 取3個(gè)不同批號(hào)的樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算每袋樣品中羥基紅花黃色素A的含量。結(jié)果見表2。

表1 羥基紅花黃色素A加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1提取溶媒及時(shí)間的考查 在供試品溶液制備方法中，提取溶媒曾使用10%甲醇、25%甲醇、50%甲醇、20%乙醇和50%乙醇，比較后用25%甲醇最宜。研究中還對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行了考查，分別超聲提取20、30、40和60 min，結(jié)果表明40 min為最佳。

3.2流動(dòng)相的選擇 本試驗(yàn)分別考查甲醇-0.4%磷酸水溶液、甲醇-乙腈-0.7%磷酸水溶液、甲醇-乙腈-0.4%磷酸水溶液對(duì)色譜峰的分離能力，也考查過不同的比例，結(jié)果表明采用甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液 (24∶2∶74)進(jìn)行洗脫，可以將羥基紅花黃色素A較好地分離。

3.3色譜柱的選擇 本試驗(yàn)分別考查了Ultimate C18色譜柱、WondaSil C18色譜柱、Agilent C18色譜柱和Phenomenex C18色譜柱對(duì)色譜峰的分離能力，結(jié)果表明采用Ultimate C18色譜柱效果最好。

綜上所述，本試驗(yàn)建立了桂枝紅花顆粒(Ⅰ)中羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定方法，以完善桂枝紅花顆粒(Ⅰ)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，參考了《中國藥典》中紅花的含量測(cè)定方法，在此色譜條件下該成分分離度較好，基線平穩(wěn)，陰性無干擾，該方法簡便準(zhǔn)確，快速易行，穩(wěn)定性好，可操作性強(qiáng)。