黃 勁 ， 高 霄 ， 雷依麗 ， 胡 婷 ， 康穎倩 ， 覃容貴

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 ， 貴州 貴陽 550025 ； 2. 貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，貴州 貴陽 550025 ； 3. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 ， 貴州 貴陽 550025)

酒精性肝病(Alcoholic liver disease, ALD)是因長(zhǎng)期過量飲酒引起的一種肝臟疾病。在西方國(guó)家，ALD是導(dǎo)致肝病患者肝硬化的主要原因[1]。在我國(guó)，近年來ALD的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，成為繼病毒性肝炎之后導(dǎo)致肝損害的第二大肝病[2]。早期病理改變?yōu)楦渭?xì)胞氧化損傷，初期常表現(xiàn)為脂肪肝，可進(jìn)展成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化，若進(jìn)一步發(fā)展成酒精性肝硬化，則難以逆轉(zhuǎn)，嚴(yán)重危害人民健康[3]。因此，尋找消除或降低酒精對(duì)人體傷害的有效藥物一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，尤其在發(fā)病初期進(jìn)行抗氧化干預(yù)，使機(jī)體免受損傷具有重要的意義。

枳椇子(HoveniadulcisThunb，HDT)為鼠李科拐棗屬植物枳椇的帶有肉質(zhì)果柄的果實(shí)或干燥成熟種子[4]，《中藥大辭典》等規(guī)定其藥用部位為帶肉質(zhì)膨大花絮軸的果實(shí)和種子。主治酒醉，煩熱，口渴、二便不利等癥[5]。本研究以人LO2細(xì)胞為研究對(duì)象，采用酒精誘導(dǎo)復(fù)制肝損傷細(xì)胞模型，通過觀察細(xì)胞活力和檢測(cè)生化指標(biāo)等，來評(píng)價(jià)枳椇子含藥血清對(duì)酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為酒精性肝損傷的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 清潔級(jí)雄性SD大鼠16只，質(zhì)量200～250 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證編號(hào)：SCXK(京)2014-0004；LO2人肝細(xì)胞株，由貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 藥材與試劑 枳椇子為鼠李科Rhamnaceae植物枳椇HoveniadulcisThunb的干燥成熟帶肉質(zhì)的果實(shí)或種子，購自遵義藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院覃容貴教授鑒定為優(yōu)質(zhì)藥材。胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；DMEM培養(yǎng)液、PBS緩沖液和0.25%胰蛋白酶溶液(Hyclone公司)；青-鏈霉素混合液(Gibco公司)；MTT、DMSO(北京索萊寶科技有限公司)；ALT、AST、SOD、MDA和總蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 儀器 臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；電熱恒溫水浴箱(天津泰斯特儀器有限公司)；-80 ℃冰箱(青島海爾特種電器有限公司)；生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司)； CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；超純水系統(tǒng)(德國(guó)默克密理博公司)；超聲破碎儀(寧波榮順科技儀器廠)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-TEK公司)。

1.4 方法

1.4.1 枳椇子水提液的制備 取枳椇子250 g加蒸餾水(料液比1∶6)，煎煮2次，第1次煎煮1.5 h，過濾，濾渣再煎煮1 h，濾過，合并濾液，濃縮至250 mL，相當(dāng)于1 g生藥/mL。

1.4.2 含藥血清制備 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為2組，即空白組(0.9% NaCl)、枳椇子組(1 g/mL 枳椇子水提液)，禁食不禁水12 h后，按照1 mL/100 g 體重灌胃，每天1次，連續(xù)7 d。于末次灌胃2 h后，用乙醚麻醉動(dòng)物，在無菌條件下，用無菌采血針心臟采血，收集于不含抗凝劑的真空采血管內(nèi)，血液室溫靜置1 h后，3 000 r/min，4 ℃，離心15 min，取血清，將同組大鼠血清混勻，56 ℃水浴滅活30 min后，過0.22 μm濾器除菌，即為枳椇子含藥血清和空白血清，分裝于無菌EP管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 細(xì)胞培養(yǎng) LO2細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，1%雙抗，以下簡(jiǎn)稱“完培”)，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞傳代，適時(shí)進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.4 肝損傷細(xì)胞模型的最佳酒精濃度的測(cè)定 將貼壁率達(dá)80%的細(xì)胞用“完培”配制成5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL。試驗(yàn)設(shè)正常組、不同濃度酒精組，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。24 h后無細(xì)胞孔設(shè)為調(diào)零孔，調(diào)零孔和正常組加入“完培”，酒精組各組的終濃度分別為25、50、100、200、400、800 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，去培養(yǎng)液，各孔加入100 μL 0.5 mg/mL的MTT，37 ℃孵育4 h，去上清液，各孔加入150 μL DMSO，于490 nm處在酶標(biāo)儀上檢測(cè)吸光度值。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=(A酒精組/A正常組)×100%(以調(diào)零孔調(diào)零)。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算不同酒精濃度下肝細(xì)胞存活率。

1.4.5 含藥血清對(duì)酒精損傷LO2細(xì)胞存活率的影響 將傳代培養(yǎng)好且貼壁率達(dá)80%的細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL。試驗(yàn)設(shè)調(diào)零孔、正常組、模型組、空白血清組、3個(gè)不同濃度含藥血清組，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)24 h后調(diào)零孔、正常組加入“完培”(10 μL/孔)，空白組加入空白血清(10 μL/孔)，給藥組依次加入含藥血清(10 μL/孔)，使終濃度分別為2.5%、5%、10%。37 ℃培養(yǎng)2 h后，調(diào)零孔和正常組加入“完培”(10 μL/孔)，其余各組加入酒精(10 μL/孔，其終濃度為1.4.4中確定的最佳酒精濃度)。37 ℃培養(yǎng)24 h后，MTT法(參照1.4.4)檢測(cè)細(xì)胞存活率。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=(A含藥血清組/A正常組)×100%(以調(diào)零孔調(diào)零)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.6 ALT、AST、SOD、MDA含量測(cè)定 細(xì)胞分別接種于48孔板和6孔板，37 ℃培養(yǎng)，試驗(yàn)設(shè)正常組、模型組、空白血清組、3個(gè)不同濃度含藥血清組，取培養(yǎng)液測(cè)ALT和AST(48孔板)；收集細(xì)胞測(cè)定MDA和SOD(6孔板)。具體步驟參照試劑盒說明書操作，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞損傷模型最佳酒精濃度的確定 結(jié)果顯示，酒精終濃度分別為25、50、100、200、400 mmol/L和800 mmol/L 時(shí)，肝細(xì)胞的存活率分別為78.87%、72.97%、66.49%、53.72%、38.60%、16.22%，見圖1。與正常組比較，各酒精處理組的存活率顯著降低，差異顯著(P<0.05)。本試驗(yàn)選擇細(xì)胞死亡率為50%左右的酒精濃度，即200 mmol/L作為后續(xù)建模濃度。

圖1 不同濃度酒精對(duì)LO2細(xì)胞存活率的影響
#：與正常組比較 ，P<0.05

2.2 MTT法檢測(cè)含藥血清對(duì)酒精損傷LO2細(xì)胞存活率的影響 模型組肝細(xì)胞存活率為55.30%，與正常組比較，存活率明顯減小(P<0.05)?？瞻籽褰M，2.5%、5%、10%含藥血清組細(xì)胞存活率分別為56.86%、58.15%、67.61%、64.48%?？瞻籽褰M與模型組比較，差異不顯著(P>0.05)；與空白血清組比較，含藥血清組中5%和10%劑量組的存活率差異極顯著或顯著(P<0.01或P<0.05)，見圖2。

圖2 枳椇子含藥血清對(duì)酒精損傷LO2細(xì)胞存活率的影響
#：與正常組比較，P<0.05；*，**：與空白血清組比較，P<0.05或P<0.01

2.3 含藥血清對(duì)酒精損傷細(xì)胞ALT 、AST、SOD和MDA含量的影響 與正常組比較，模型組ALT、AST和MDA含量明顯增高，而SOD酶活性明顯降低(P<0.01)；與空白血清組比較，5%劑量含藥血清組ALT含量顯著降低(P<0.05)；5%和10%含藥血清組AST含量極顯著低于空白血清組(P<0.01)；各劑量含藥血清組，SOD活性均升高，MDA含量均下降，差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)，見表1。

表1 枳椇子含藥血清對(duì)酒精損傷LO2細(xì)胞ALT、AST、SOD和MDA含量的影響

##：與正常組比較，P<0.01； *，**：與空白血清組比較，P<0.05或P<0.01

3 討論

血清藥理學(xué)是指將一種含藥血清施加于體外試驗(yàn)反應(yīng)體系，用于研究藥物，尤其是中藥和復(fù)方藥藥效及藥理的試驗(yàn)技術(shù)方法[6-7]。其中“含藥血清”，是指動(dòng)物經(jīng)口服或灌胃給予一定劑量藥物之后，經(jīng)過一段時(shí)間連續(xù)給藥處理后，收集血液，經(jīng)離心后所得到的血清。血清藥理學(xué)方法自1986年日本學(xué)者Hiroko Iwama首次提出后[8]，經(jīng)過多年的努力和改進(jìn)，已經(jīng)被廣大學(xué)者所接受，并成為研究中藥藥效的有效方法。較之將生藥直接加入試驗(yàn)體系的傳統(tǒng)藥理學(xué)而言，該方法能較好地反映藥物的藥效，有助于研究中藥藥效物質(zhì)及其在體內(nèi)的代謝過程[6]。因此，本試驗(yàn)采用血清藥理學(xué)方法制備枳椇子含藥血清，在細(xì)胞水平上探討枳椇子對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

枳椇子作為古老的醒酒解酒藥食兩用植物，被歷代醫(yī)生所用。本試驗(yàn)利用200 mmol/L酒精處理LO2細(xì)胞，構(gòu)建了人酒精性肝損傷細(xì)胞模型，采用臨床上常見生化指標(biāo)ALT 和 AST評(píng)價(jià)肝損傷程度和預(yù)后效果。結(jié)果顯示，模型組ALT和AST活力分別為(21.12±3.671)U/L和(36.41±3.533)U/L，與正常組(5.66±1.273)U/L和(13.24±3.083)U/L比較，模型組ALT和AST活力均顯著增加，但預(yù)先用枳椇子含藥血清處理的各劑量含藥血清組均能抑制酒精所造成的轉(zhuǎn)氨酶活性升高，其中5%含藥血清組ALT和AST活力分別為(8.097±2.514)U/L和(19.10±1.442)U/L，極顯著降低了轉(zhuǎn)氨酶活性。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，提前給予枳椇子處理對(duì)急性酒精性肝損傷具有保護(hù)作用。

越來越多的研究顯示，酒精暴露對(duì)肝臟損傷的機(jī)制中，氧化應(yīng)激在酒精性肝病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[9]。氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)高活性分子產(chǎn)生過多，如活性氧(Reactive oxygen species, ROS)和活性氮自由基(Reactive nitrogen species, RNS)等，超出機(jī)體清除氧化物的能力，從而導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡的一種應(yīng)激狀況[10]。進(jìn)入體內(nèi)的酒精，大部分(>90%)需在肝臟中代謝，包括細(xì)胞質(zhì)的酒精脫氫酶系統(tǒng)、微粒體的酒精氧化系統(tǒng)和線粒體的乙醛脫氫酶等[11]，在經(jīng)上述途徑將酒精轉(zhuǎn)化為CO2和H2O的過程中，都會(huì)產(chǎn)生ROS。ROS能夠與生物大分子反應(yīng)造成蛋白質(zhì)和酶變性失活、DNA結(jié)構(gòu)改變、生物膜脂質(zhì)過氧化，從而造成細(xì)胞損傷。正常情況下，機(jī)體內(nèi)含有多種清除ROS的酶或抗氧化物質(zhì)，如SOD、GSH、維生素E、維生素C等，但大量酒精的攝入，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過多ROS，無法被抗氧化物質(zhì)完全清除時(shí)，會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，過度的ROS可啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致終產(chǎn)物丙二醛(MDA)等增多，SOD等活性下降，最終導(dǎo)致線粒體膜損傷，肝細(xì)胞受損[12]。本試驗(yàn)顯示，與正常組(1.413±0.243 4)nmoL/mg MDA含量和(56.32±3.655) U/mg SOD酶活力相比，模型組LO2細(xì)胞MDA含量(2.37±0.06)nmoL/mg顯著增加，SOD活力(2.37±0.06)U/mg顯著下降。但提前給予枳椇子含藥血清處理，各含藥血清組均顯著抑制酒精導(dǎo)致的肝細(xì)胞MDA升高和SOD活性的降低，其中5%含藥血清組差異尤為顯著，其MDA和SOD水平分別為(1.517±0.195) nmoL/mg和(50.65±2.71)U/mg。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，枳椇子可能是通過上調(diào)SOD酶活性，減少氧化應(yīng)激，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果提示，枳椇子對(duì)急性酒精性肝損傷具有預(yù)防保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過促進(jìn)抗氧化酶的活性，抑制氧化應(yīng)激作用來實(shí)現(xiàn)。