李 強(qiáng) ， 科爾沁滿來(lái) ， 李鵬輝 ， 張 雪 ， 范奎奎 ， 海日罕 ， 杜晨光,

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018 ； 2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古 包頭 014109)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成類固醇激素(如雌激素和雄激素)參與調(diào)解生殖、能量代謝及內(nèi)分泌等多種功能[1]。腦內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)均有以膽固醇為起始物類固醇激素酶類的合成，且合成過(guò)程需要一系列酶類參與，如細(xì)胞色素P450 17A1(CYP17A1)、類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白以及3B羥基類固醇脫氫酶1在類固醇合成過(guò)程中具有積極作用[2]。

細(xì)胞色素P450超家族血紅素混合功能氧化酶調(diào)節(jié)多種生理功能，包括其類似藥物以及外源性物質(zhì)對(duì)于激素和維生素生物合成的影響[3]。細(xì)胞色素P450 17A1是其家族中的一員，在類固醇激素合成過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)前體物(膽固醇)轉(zhuǎn)化為鹽皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素或性激素等，同時(shí)也是具有多重性功能的酶，可催化17α羥基化反應(yīng)以及17,20裂解反應(yīng)[4]。

由于CYP17A1可催化類固醇激素的合成及代謝，因而在目前的許多研究中都將其作為治療類固醇激素相關(guān)疾病的關(guān)鍵點(diǎn)，涉及內(nèi)分泌紊亂、肥胖、以及肥胖引發(fā)的高血壓、糖尿病等[5]。有文獻(xiàn)證實(shí)CYP17A1可間接影響腦內(nèi)其他蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)相應(yīng)生理功能[6]，提示CYP17A1與類固醇激素參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能。目前研究主要集中在睪丸、卵巢、腎上腺等組織，鮮有CYP17A1在腦內(nèi)有表達(dá)的報(bào)導(dǎo)。為此，本試驗(yàn)檢測(cè)了小鼠腦組織內(nèi)CYP17A1神經(jīng)元分布，為研究其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能存在功能提供神經(jīng)學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠，購(gòu)自北京維通利華生物科技有限公司，經(jīng)自群繁育后(避免近交)，獲得適應(yīng)現(xiàn)有飼養(yǎng)條件的7周齡雄性小鼠(n=6),體重23～25 g。

1.2 方法

1.2.1 組織獲取和保存 用于免疫熒光試驗(yàn)的小鼠(n=6)經(jīng)3 %戊巴比妥鈉深度麻醉，使用灌注泵經(jīng)心肺以3 mL/min灌注5 min生理鹽水約15 mL，后分別以5 mL/min灌注固定液(4 %多聚甲醛)40 min約200 mL，取各組小鼠腦組織置于固定液中后固定過(guò)夜，修塊后轉(zhuǎn)移至30 %蔗糖溶液中直至完全沉降。使用冰凍切片機(jī)對(duì)腦組織冠狀面連續(xù)切片，厚度為30 μm，漂片法洗滌，4 ℃保存，并加入疊氮化鈉(NaN3)防腐。

1.2.2 免疫熒光 使用冰凍切片機(jī)包埋劑(OCT，SLEE)包埋脫水后的腦組織，于冰凍切片機(jī)(SLEE MNT)連續(xù)切片，厚度為30 μm，按順序置于0.02 mol/L PBS(pH值=7.4)的12孔板內(nèi)。選取不同位置腦片經(jīng)(1%triton+0.4%SDS+PBS) 4 ℃搖床(80 r/min)預(yù)處理4 h。3%標(biāo)準(zhǔn)驢血清(NDS)室溫(29 ℃)封閉1 h，4 ℃過(guò)夜孵育一抗(CYP17A1，兔單克隆，1∶200，Abcam ab125022)、然后室溫孵育二抗2 h (ALexa647, 驢抗兔；1∶2 000, Abcam ab150075)。每步結(jié)束后用PBS清洗3次，每次10 min。然后將切片整齊的貼于載玻片，待其完全干燥后，激光共聚焦(Nikon C2)647波段進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果

CYP17A1熒光信號(hào)存在于小鼠腦內(nèi)特定神經(jīng)核團(tuán)，呈廣泛性分布。根據(jù)小鼠腦3D圖譜并結(jié)合小鼠腦立體定位圖譜(見(jiàn)中插彩版圖1A-D)， CYP17A1在小鼠腦內(nèi)各區(qū)域的分布如下。

前腦：CYP17A1熒光信號(hào)形態(tài)清晰飽滿，集中分布在內(nèi)臟區(qū)(VISC，見(jiàn)中插彩版圖1J)、軀體感覺(jué)區(qū)(SSs，見(jiàn)中插彩版圖1H)，在主要體覺(jué)區(qū)(SSp，見(jiàn)中插彩版圖1H)、海馬、丘腦室旁核(PVT，見(jiàn)中插彩版圖1G)、脾后區(qū)(RSP)等處有零散分布，其他區(qū)域未見(jiàn)表達(dá)。

下丘腦區(qū)：CYP17A1熒光信號(hào)在下丘腦室旁核(PVN，見(jiàn)中插彩版圖1F)、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(VMH，見(jiàn)中插彩版圖1L)處呈明顯區(qū)域性分布。下丘腦外側(cè)區(qū)(LHA，見(jiàn)中插彩版圖1K)有較為分散的陽(yáng)性信號(hào)。其他區(qū)域亦見(jiàn)零星分布(見(jiàn)中插彩版圖1E-L)。

后腦腦干：CYP17A1熒光信號(hào)在蝸腹側(cè)核后部(VCO，見(jiàn)中插彩版圖1T)、藍(lán)斑(LC，見(jiàn)中插彩版圖1N)、舌下神經(jīng)核(12N，見(jiàn)中插彩版圖1V)、外側(cè)網(wǎng)狀核(LRNm，見(jiàn)中插彩版圖1X)中有豐富表達(dá)。巨細(xì)胞網(wǎng)狀核(GRN，見(jiàn)中插彩版圖1O/P)、臂旁核(PB，見(jiàn)中插彩版圖1R)等核團(tuán)中亦見(jiàn)少量零散分布(見(jiàn)中插彩版圖1M-X)。

圖1 小鼠腦內(nèi)CYP17A1熒光信號(hào)的分布小鼠腦形態(tài)模擬圖(A-D)，下丘腦室旁核(PVN, E,F)，下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(VMH, L),下丘腦外側(cè)區(qū)(LH, I,K)，內(nèi)臟區(qū)(VISC, I,J)，

3 討論

目前未見(jiàn)小鼠腦內(nèi)CYP17A1神經(jīng)元分布的報(bào)道。本試驗(yàn)檢測(cè)了CYP17A1在小鼠腦內(nèi)的分布，結(jié)果表明，CYP17A1神經(jīng)元在小鼠腦內(nèi)多個(gè)核團(tuán)均有表達(dá)，如下丘腦的PVN、VMH、LHA核團(tuán)及腦干內(nèi)的LC、NTS、12N等區(qū)域均檢測(cè)到CYP17A1神經(jīng)元分布。上述區(qū)域與已報(bào)到的類固醇類激素或受體的分布吻合，推測(cè)CYP17A1可能在這些區(qū)域內(nèi)調(diào)節(jié)類固醇激素的合成及其功能的發(fā)揮。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在著各類細(xì)胞集合而成的大量核團(tuán)和神經(jīng)纖維，可接收來(lái)自機(jī)體各處信息，通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸反饋?zhàn)饔眠M(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的內(nèi)分泌活動(dòng)。類固醇類激素(如雌激素及雄激素)在調(diào)節(jié)生殖及能量代謝平衡中發(fā)揮重要作用，睪酮可在CYP17A1等酶的作用下轉(zhuǎn)化為雌二醇。嚙齒類及靈長(zhǎng)類動(dòng)物腦中有雌二醇和睪酮及其受體的廣泛分布，雌激素受體(ER)及雄激素受體(AR)被認(rèn)為是細(xì)胞對(duì)雌激素和雄激素應(yīng)答的媒介。雌激素受體主要分布在間腦視前區(qū)、中腦間核及下丘腦的弓狀核、室旁核、腹內(nèi)側(cè)核，雌二醇作為主要的雌激素與其受體結(jié)合后，可降低母雞的產(chǎn)蛋量、蛋的受精率及公雞的產(chǎn)精能力[7]；在去勢(shì)大鼠腦組織中雌二醇可影響G蛋白偶聯(lián)雌激素受體的表達(dá)[8]；雄激素受體主要分布在丘腦內(nèi)包括弓狀核、腹、背側(cè)核和室旁核等處，睪酮與雄激素受體結(jié)合對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一些列調(diào)控作用，包括可直接通過(guò)下丘腦-垂體軸調(diào)節(jié)垂體中黃體生成素和卵泡刺激素的釋放[8]。

同時(shí)CYP17A1在體內(nèi)的表達(dá)亦受多種因素的調(diào)節(jié)，如食欲素B影響豬子宮中CYP17A1的表達(dá)、敲除Mamld1可減少小鼠睪丸腫瘤細(xì)胞中CYP17A1的表達(dá)、蛋白激酶C在腎上腺中可抑制CYP17A1的表達(dá)[9]。提示通過(guò)調(diào)節(jié)特定區(qū)域中CYP17A1的活性，可對(duì)生殖、內(nèi)分泌及某些疾病的預(yù)防和治療起到積極意義。

綜上，結(jié)合類固醇激素在腦內(nèi)核團(tuán)中的作用，推測(cè)CYP17A1在小鼠腦內(nèi)與調(diào)節(jié)相關(guān)類固醇激素合成及功能的發(fā)揮積極相關(guān)。