王顯峰 , 白薩日娜

(扎蘭屯職業(yè)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古 扎蘭屯 162650)

研究表明，寵物犬相關(guān)疾病逐漸增多，如犬瘟熱、細(xì)小病毒、寄生蟲蟲病、腹瀉、子宮內(nèi)膜炎等[1]。因此，在寵物犬養(yǎng)殖過程中，應(yīng)該注意相關(guān)疾病的預(yù)防，定期檢測、免疫，同時還要注意環(huán)境衛(wèi)生與消毒。臨床中母犬生殖系統(tǒng)疾病逐漸增多，尤其是子宮內(nèi)膜炎發(fā)生頻率逐漸增多，成為母犬生殖系統(tǒng)疾病中重要疾病之一，寵物犬的子宮內(nèi)膜炎大多數(shù)由于產(chǎn)后護理不當(dāng)或者外界細(xì)菌感染后引起的子宮內(nèi)膜炎癥病變，寵物犬子宮感染細(xì)菌后可以引起子宮的嚴(yán)重?fù)p傷，同時可以繼發(fā)其他的器官感染[2-3]。臨床中許多病原菌均可以引起動物子宮內(nèi)膜炎，嚴(yán)重者可以引起死胎、流產(chǎn)[4]。臨床中關(guān)于奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌的報道較多，致寵物犬子宮內(nèi)膜炎病原菌報道的較少。本試驗從寵物醫(yī)院采集患子宮內(nèi)膜炎犬的內(nèi)容物、陰道分泌物等病料組織240份，進行病原菌分離鑒定、致病性檢測及耐藥性分析，為寵物犬子宮內(nèi)膜炎治療用藥提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 采集呼倫貝爾地區(qū)寵物醫(yī)院患子宮內(nèi)膜炎寵物犬的內(nèi)容物、陰道分泌物等病料組織240份。

1.2 試劑與儀器 增菌培養(yǎng)基、哥倫比亞培養(yǎng)基、7%綿羊血培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色鑒別培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，均購自成都康迪生物科技有限公司；大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌生化鑒定試劑盒、藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司；革蘭陰性、陽性菌基因組 DNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；梯度PCR儀、離心機、隔水式恒溫培養(yǎng)箱等儀器由本實驗室提供。

1.3 實驗動物 體重(25±2.2)g健康昆明系雌性小鼠290只，購自呼倫貝爾市實驗動物中心。

1.4 分離與鑒定 將采集的患子宮內(nèi)膜炎寵物犬的子宮內(nèi)容物、陰道分泌物等病料組織進行處理，接種到增菌液中，37 ℃震蕩培養(yǎng)12-18 h，取擴增菌液中病原菌分別接種于哥倫比亞培養(yǎng)基、7%綿羊血培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色鑒別培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基進行鑒別培養(yǎng)，挑取鑒別培養(yǎng)基上單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯中進行純化培養(yǎng)，取純化培養(yǎng)的分離菌株進行染色鏡檢和生化試驗。

1.5 細(xì)菌生化試驗 按照說明書，調(diào)整純化培養(yǎng)的分離菌株菌液濃度，分別接種于大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌生化鑒定試紙條中培養(yǎng)，用自動細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)鑒定。

1.6 細(xì)菌的PCR鑒定 參考文獻[5-6]，設(shè)計大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌保守區(qū)基因序列特異引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用革蘭陰性、陽性菌基因組 DNA 提取試劑盒提取分離株的基因組DNA，用特異性引物進行PCR鑒定，其PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄參考株的基因序列進行同源性比對。

1.7 細(xì)菌致病性試驗 參考文獻[5]，調(diào)整分離菌株的菌液濃度為1.0×108CFU/mL，將290只小鼠隨機分為145組，每組2只，試驗組為1～144組，每株菌株為1個試驗組，陰道注射2只小鼠，劑量為0.25 mL，145組為對照組，給予等量的無菌PBS，攻毒后觀察6 d，記錄發(fā)病死亡情況并進行細(xì)菌鑒定。

表1 引物序列

1.8 藥敏試驗 參照用美國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)2018年推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進行，按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進行結(jié)果判斷，分析耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定 疑似大腸桿菌的分離菌株在大腸桿菌顯色鑒別培養(yǎng)基長出圓形的、邊緣整齊的綠色的菌落，鏡檢呈兩端鈍圓桿狀陰性菌；疑似鏈球菌分離菌株在7%綿羊血培養(yǎng)基、哥倫比亞培養(yǎng)基上長出了圓形的、大小一致的、略帶黏液樣菌落呈現(xiàn)β溶血，鏡檢呈單個散在或多個球形陽性菌；疑似金黃色葡萄球菌在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上長出圓形的、邊緣整齊的淺黃色菌落，在7%綿羊血培養(yǎng)基呈現(xiàn)β溶血，鏡檢呈單個短鏈和成堆的葡萄串狀排列的陽性球菌。

2.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果 55株菌株的V-P試驗呈陰性、吲哚和甲基紅反應(yīng)為陽性，能分解甘露醇、葡萄糖、麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，被鑒定為大腸桿菌； 48株菌株的靛基質(zhì)試驗陰性、V-P試驗和過氧化氫酶試驗陽性，分解葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖，且產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，被鑒定為金黃黃色葡萄球菌；40株菌株的V-P試驗為陽性，發(fā)酵乳糖、七葉苷、水楊酸、山梨醇；不發(fā)酵核糖、甘露醇、菊糖及棉籽糖，被鑒定為鏈球菌。

2.3 細(xì)菌PCR鑒定 PCR鑒定結(jié)果顯示，55株分離株擴增出大腸桿菌目的基因片段231 bp，48株分離菌株擴增出金黃黃色葡萄球菌目的基因片段418 bp，40株分離菌株擴增出鏈球菌目的基因片段874 bp。測序結(jié)果：3種病原菌的測序結(jié)果與GenBank庫中登錄的分離的大腸桿菌、金黃黃色葡萄球、鏈球菌參考株基因序列同源性97.9%～99.9%之間。從而證明了從采集的病料組織240份中分離得到了56株大腸桿菌、48株致病性試驗結(jié)果金黃色葡萄球菌、40株鏈球菌。

2.4 致病性試驗結(jié)果 試驗組小鼠在攻毒后的3-4 d出現(xiàn)精神沉郁、采食量減少、外陰部出現(xiàn)腫脹、流出膿性黏液，個別小鼠出現(xiàn)死亡。從發(fā)病死亡的的小鼠體內(nèi)分離到大腸桿菌、金黃黃色葡萄球菌、鏈球菌。對照組小鼠無明顯的癥狀。根據(jù)試驗結(jié)果統(tǒng)計，42株大腸桿菌、32株金黃色葡萄球菌、30株鏈球菌對小鼠具有致病性。

2.5 耐藥性分析結(jié)果 試驗結(jié)果見表2， 42株致病性大腸桿菌對強力霉素、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、大觀霉素、青霉素G、阿莫西林、氨芐西林9種藥物的耐藥率在45.2%～100%之間，對林可霉素、恩諾沙星、頭孢噻呋、頭孢曲松4種藥物的耐藥率在11.9%～28.6%之間；32株致病性金黃色葡萄球菌對氟苯尼考、大觀霉素、強力霉素、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶、環(huán)丙沙星、青霉素G、氨芐西林、阿莫西林9種藥物的耐藥率在42.9%～100%之間；林可霉素、恩諾沙星、頭孢噻呋、頭孢曲松耐藥率在12.5%～25.0%；30株致病性鏈球菌對青霉素G、阿莫西林、氨芐西林、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、大觀霉素、強力霉素、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶9種藥物耐藥率在40.0%～96.7%之間，對頭孢噻呋、頭孢曲松、恩諾沙星、林可霉素4種藥物耐藥率在13.3%～33.3%之間。

表2 耐藥性分析結(jié)果

3 討論

臨床中許多病原菌均可以引起動物子宮內(nèi)膜炎，嚴(yán)重者可以引死胎、流產(chǎn)，引起寵物犬子宮內(nèi)膜炎的病原菌主要包含大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌等[6-7]。本試驗從呼倫貝爾地區(qū)寵物醫(yī)院采集患子宮內(nèi)膜炎寵物犬的子宮內(nèi)容物、陰道分泌物等病料組織240份，通過采用細(xì)菌學(xué)鑒定和PCR法分離得到了56株大腸桿菌、48株金黃色葡萄球菌、40株鏈球菌，通過人工感染動物試驗對分離的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌驗證其致病性，結(jié)果顯示，42株大腸桿菌、32株金黃色葡萄球菌、30株鏈球菌對小鼠具有致病性，說明致寵物犬子宮內(nèi)膜炎病原菌以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌為主。劉明達等[3]報道了從石河子市部分寵物醫(yī)院采集的48例患病犬的陰道分泌物和子宮內(nèi)容物中分離出58株致病菌，其中主要包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、鏈球菌等。與本試驗結(jié)果存在差異性可能與地區(qū)有關(guān)。國內(nèi)關(guān)于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌引起奶牛子宮內(nèi)膜炎報道較多，關(guān)于寵物犬報道較少。因此，本試驗對分離的致寵物犬子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌進行耐藥性分析。

在小動物臨床治療中為了控制細(xì)菌性感染，抗菌藥物不合理使用，很容易導(dǎo)致很強的耐藥性，由于寵物犬與人接觸，其攜帶的耐藥菌有可能通過親密接觸在人類中傳播[8-9]。本試驗藥敏試驗結(jié)果表明，42株大腸桿菌對強力霉素、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶等9種藥物的耐藥率在45.2%～100%之間，32株金黃色葡萄球菌對氟苯尼考、大觀霉素、強力霉素等9種藥物的耐藥率在42.9%～100%之間，30株致病性鏈球菌對青霉素G、阿莫西林、氨芐西林等9種藥物耐藥率在40.0%～96.7%之間。說明在臨床中對寵物犬的子宮內(nèi)膜炎的治療時，不合理的使用抗菌藥物，造成寵物犬源致病菌產(chǎn)生很強的耐藥性。因此，在臨床治療相關(guān)疾病應(yīng)該引起重視。