劉麗娟 ， 馬光強(qiáng) ， 王 偉 ， 王開功 ， 周碧君

(1.貴州省都勻市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 ， 貴州 都勻 558000 ；2.黔南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 貴州 都勻 558000 ； 3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 貴州 貴陽 550025)

仔豬腹瀉是全球養(yǎng)豬業(yè)面臨的豬群常發(fā)疾病之一，具有高發(fā)病率、高死亡率等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1]。引發(fā)仔豬腹瀉的病原有很多，包括大腸埃希菌、魏氏梭菌、豬痢疾密螺旋體、流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、豬球蟲、豬蛔蟲等[2]。其中大腸埃希菌一直被認(rèn)為是引發(fā)仔豬腹瀉的重要病原之一，可引發(fā)仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病[3]。由于大腸埃希菌血清型眾多，各地區(qū)的流行菌株不一，導(dǎo)致疫苗預(yù)防效果并不理想，養(yǎng)殖戶為降低腹瀉發(fā)病率，常在生產(chǎn)活動(dòng)中大量添加抗生素[4]。為此大腸埃希菌耐藥菌株不斷增多，耐藥機(jī)制也日趨復(fù)雜，致使細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重，防治難度越來越大。如何有效防治豬大腸埃希菌病成為規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)亟需解決的難題。為了解貴州地區(qū)仔豬腹瀉大腸埃希菌病流行情況和耐藥的情況，本試驗(yàn)對(duì)2016年4月-7月間采集于貴州地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的128份腹瀉仔豬腸道樣本進(jìn)行了細(xì)菌的分離鑒定、致病力試驗(yàn)及耐藥性分析，旨在為豬大腸埃希菌病的防控提供參考理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2016年4-7月間采集貴州省4個(gè)地(州、市)7個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)腹瀉癥狀的仔豬腸內(nèi)容物128份，4 ℃保存送至貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究室立即做細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管、藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DL-2 000 DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。大腸埃希菌質(zhì)控菌株ATCC25922由貴州省動(dòng)物疫病研究室保存。

1.3 引物 根據(jù)大腸埃希菌的保守基因序列特征，參考馬光強(qiáng)[5]2016年報(bào)道的大腸埃希菌特異性鑒定引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 通用鑒定基因PCR引物序列

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.5 細(xì)菌分離培養(yǎng)及生化鑒定 取腹瀉仔豬腸道樣品接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，將增菌液用接種環(huán)在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行“Z”字型劃線，37 ℃培養(yǎng)18-24 h 后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)、革蘭染色鏡檢，并用腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行生化鑒定。

1.6 PCR鑒定 以細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒所提取分離菌基因組總DNA為模板，應(yīng)用表1中引物進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 10.0 μL、基因組DNA模板1.0 μL、上下游引物各1.0 μL(10 μL mol/L)、加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 40 s；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 將鑒定的大腸埃希菌菌液按0.2 mL/只(5.9×108CFU/mL)劑量，腹腔注射小鼠，空白對(duì)照組小鼠，腹腔注射0.2 mL滅菌生理鹽水。觀察并剖檢發(fā)病和死亡的小鼠，統(tǒng)計(jì)致死率，組織采樣后回接至麥康凱瓊脂，取優(yōu)勢(shì)細(xì)菌染色觀察并與初始培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)比。

1.8 藥物敏感性試驗(yàn) 按照細(xì)菌藥敏試紙使用說明書及美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)2012年制定的藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)(K-B 法)進(jìn)行，將分離菌接種在 LB 液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，分別均勻涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，選取4大類抗生素共 12 種常見藥敏紙片貼于培養(yǎng)基上，置 37 ℃培養(yǎng) 24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，按該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。以大腸埃希菌 ATCC 25922 作為質(zhì)控菌株。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及生化鑒定 128份樣本有78份在麥康凱培養(yǎng)基上均長(zhǎng)出邊緣光滑整齊、濕潤(rùn)、粉紅色扁圓形小菌落(中插彩版圖1)；挑取典型菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，可見菌體為兩端鈍圓、紅色、散在或者成雙排列的革蘭陰性桿菌(中插彩版圖2)。生化鑒定結(jié)果顯示，78株分離菌靛基質(zhì)、甲基紅、葡萄糖(產(chǎn)氣) 、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、木糖試驗(yàn)均呈陽性; 硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、枸櫞酸鹽、尿素、側(cè)金盞花醇、氨基酸對(duì)照試驗(yàn)均呈陰性; 半固體瓊脂動(dòng)力試驗(yàn)中僅有11株菌運(yùn)動(dòng)性呈陰性，其他均呈陽性。根據(jù)腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管第二代15e系列檢索表，按照鑒定值查找編碼結(jié)果顯示，78株分離菌均為大腸埃希菌，分離率為61%(78/128)。

圖1 分離菌在血平板上的生長(zhǎng)情況

圖2 分離菌革蘭染色顯微鏡下觀察結(jié)果(×1 000)

2.2 大腸埃希菌分子生物學(xué)方法鑒定 將用傳統(tǒng)方法分離鑒定的78株大腸埃希菌按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，并以此為模板進(jìn)行大腸埃希菌23S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，78株大腸埃希菌均擴(kuò)增出條帶單一明亮的特異性條帶。

通過生化和PCR鑒定方法分離鑒定到的大腸埃希菌進(jìn)行符合率統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，PCR鑒定方法與傳統(tǒng)生化鑒定的結(jié)果一致，符合率達(dá) 100%(78/78)。

圖3 大腸埃希菌PCR擴(kuò)增結(jié)果
M：DL-2 000 DNA Marker ; 1:陽性對(duì)照 ；2～5：分離菌株 ； N：陰性對(duì)照

2.3 大腸埃希菌致病性試驗(yàn) 將分離鑒定的78株大腸埃希菌進(jìn)行動(dòng)物致病性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組BALB/c小鼠注射菌液后均出現(xiàn)昏睡、厭食、被毛蓬亂、反應(yīng)遲鈍、精神萎靡等癥狀，少數(shù)可見拉稀癥狀；剖檢可見腹腔充滿黏性黃色滲出物，肝臟和腎脾腫大，腸道膨脹充氣等病變。78株大腸埃希菌分離株中有56株均在48-72 h內(nèi)致小鼠死亡，致死率71.79%(56/78)，而對(duì)照組小鼠無發(fā)病死亡。從死亡小鼠的肝臟和腹腔滲出液分離到培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)均相同的分離菌，經(jīng)PCR鑒定為大腸埃希氏菌。

2.4 致病性大腸埃希菌耐藥表型分析 對(duì)分離鑒定的大腸埃希菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，分離鑒定的78株大腸埃希菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物青霉素耐藥率最高，為94.87%(74/78)，對(duì)磺胺類藥物復(fù)方新諾明耐藥率最低，為21.79%(17/78)，對(duì)其余抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的廣泛耐藥。

表2 78株致病大腸埃希菌分離株對(duì)12種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

2.5 大腸埃希菌多重耐藥性分析結(jié)果 本試驗(yàn)受試抗菌藥物屬于4類，3種為磺胺類，3種為氟喹諾酮類，3種β酰胺類，3種氨基糖苷類，多重耐藥結(jié)果可知，78株大腸埃希菌分離株均為多重耐藥菌株，其中2株耐3種藥，耐藥率為2.6%(2/78)；5株耐4種藥，耐藥率為6.4%(5/78)；4株耐5種藥，耐藥率為5.1%(4/78)；2株耐6種藥，耐藥率為2.6%(2/78)；11株耐7種藥，耐藥率為14.1%(11/78)；15株耐8種藥，耐藥率為19.2%(15/78)；17株耐9種藥，耐藥率為21.7%(17/78)；8株耐10種藥，耐藥率為10.2%(8/78)；14株耐11種藥，耐藥率為17.9%(14/78)。 所有分離菌株均為多重耐藥菌株，多重耐藥主要表現(xiàn)在7～11耐，占分離菌株的83.33%(65/78)。

3 討論

近年來，隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，仔豬腹瀉的發(fā)生與流行有明顯增加的趨勢(shì)。豬腹瀉對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，仔豬最為嚴(yán)重。大腸埃希菌作為條件性致病菌，當(dāng)外界環(huán)境改變、應(yīng)激、飼料霉變等均易誘發(fā)本病[6]。大腸埃希菌引起的仔豬腹瀉因發(fā)病日齡不同臨床癥狀不同，仔豬黃痢主要發(fā)生在 1-3日齡內(nèi)新生仔豬，仔豬白痢主要發(fā)生在10-30日齡哺乳仔豬，豬水腫病引起的腹瀉主要發(fā)生在斷奶后仔豬[7]。通常情況下，大腸埃希菌病的發(fā)病率和死亡率均較高，也是一類重要的人獸共患病。因此，對(duì)豬大腸埃希菌病應(yīng)采取及時(shí)有效的防治措施。

本試驗(yàn)從貴州省4個(gè)地(州、市)7個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)腹瀉癥狀的128份仔豬腸內(nèi)容物中共分離到78株豬源大腸埃希菌，分離率為60.94(78/128)；這一結(jié)果低于馬長(zhǎng)賓等(2016)[8]從新疆7個(gè)規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)361份豬腹瀉腸道樣本中共分離到335株豬大腸埃希菌的分離率92.80%(335/361)，以及劉哲等(2017)[9]從河南省1個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)1～7日齡腹瀉仔豬69份肛拭子樣品中共分離到69株豬大腸埃希菌的分離率100%(69/69)；高于李金鵬等(2018)[10]從河南省15家豬場(chǎng)腹瀉病豬152份腸內(nèi)容物中共分離到79豬豬源大腸埃希菌的分離率為51.97%(79/152)。這些差異可能是由于地域差異、動(dòng)物健康程度不同或不同養(yǎng)豬場(chǎng)的用藥情況不同所致。

近年來，用于防治仔豬大腸埃希菌病的藥物常為抗生素，在應(yīng)用抗生素的過程中不僅會(huì)殺滅病原菌，還會(huì)使得正常菌群失調(diào)，從而降低動(dòng)物機(jī)體的抵抗力，且長(zhǎng)期不合理使用更易產(chǎn)生耐藥性[11]。本試驗(yàn)分離的78株大腸埃希菌對(duì)青霉素、氨芐西林、哌拉西林、慶大霉素、卡那霉素的耐藥率較高，耐藥率均超過80%；對(duì)其他試驗(yàn)抗生素的耐藥率均在20%～80%之間。這與劉哲等(2017)[9]、楊宇(2017)[12]和吳學(xué)敏等(2017)[13]的報(bào)道基本一致，但與谷振等(2018)[14]、趙曉黎(2017)[15]和艾偉昌等(2017)[16]的報(bào)道存在明顯差異。這種差異可能是因地域不同、動(dòng)物種類不同、動(dòng)物健康程度不同或不同養(yǎng)殖場(chǎng)的用藥情況不同所致。從多重耐藥情況來看，貴州省仔豬腹瀉致病性大腸埃希菌多重耐藥情況嚴(yán)重，3耐及3耐以上菌株高達(dá)100%，這一結(jié)果均高于艾偉昌等(2017)[16]、寧昆等(2016)[17]及蒲承君等(2017)[18]的研究。表明大腸埃希菌多重耐藥受多種因素的影響。

仔豬腹瀉病因復(fù)雜，往往是由多種因素共同作用的結(jié)果，如許多病毒性疫病、其他細(xì)菌性疫病、某些寄生蟲病等[19]。雖然本次試驗(yàn)結(jié)果不足以說明分離獲得的大腸埃希菌是引發(fā)仔豬腹瀉的唯一因素，但根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整臨床用藥，腹瀉仔豬癥狀得到了緩解和控制。因此建議豬場(chǎng)避免使用或添加同類抗生素，定期對(duì)本地分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)篩選出敏感藥物，采取聯(lián)合用藥、交叉用藥和輪換用藥等方式，可減少耐藥性的產(chǎn)生。