張 瑋 ， 張啟龍 ， 王羽新 ， 劉海瑩 ， 王 林 ， 傅彩霞 ， 周德剛

(1.北京市動物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京 大興 102609 ； 2.中國動物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京 朝陽 100125)

寵物犬的腹瀉為臨床中常見的疾病之一，引起腹瀉的病原主要有致病性大腸桿菌、沙門菌、綠膿桿菌、巴氏桿菌等，其中，致病性大腸桿菌是引起寵物犬腹瀉最為常見的疾病[1]。寵物犬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的犬急性腸道傳染性疾病，患犬主要癥狀為腹瀉，有敗血癥表現(xiàn)，可引起泌尿系統(tǒng)感染、睪丸炎、子宮內(nèi)膜炎等，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡[2]。寵物犬大腸桿菌病主要通過抗生素進(jìn)行治療，由于抗生素的不合理使用，寵物犬源大腸桿菌產(chǎn)生了很強的耐藥性，寵物犬長期與人接觸可能會把攜帶耐藥性的大腸桿菌傳播給人類，應(yīng)引起高度重視[3]。本試驗通過對北京市某動物醫(yī)院1例患頑固性腹瀉病例的寵物犬無菌采集肛門拭子，經(jīng)病原檢測、細(xì)菌分離與形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定等試驗分離出1株大腸桿菌，命名為37-Canine株。對分離出的37-Canine株的致瀉型、耐藥性及16S rDNA序列進(jìn)行了分析，旨在為由犬源大腸桿菌引起腹瀉病例的治療用藥選擇提供指導(dǎo)，避免盲目用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 北京市某動物醫(yī)院1例就診頑固性腹瀉寵物犬，應(yīng)用了慶大霉素、阿莫西林等藥物均未見好轉(zhuǎn)，犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬冠狀病毒等病原膠體金試紙檢測均為陰性。無菌采集病犬肛門拭子，裝入滅菌PBS離心管中并標(biāo)記，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、營養(yǎng)肉湯，均購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡，購自梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；5種致瀉型大腸桿菌核酸檢測試劑盒，購自深圳生科原生物股份有限公司；細(xì)菌DNA核酸提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 主要儀器 QuantStudio7 Flex熒光定量PCR儀，由美國AB公司生產(chǎn)；全自動革蘭染色儀、VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，由法國梅里埃公司生產(chǎn)；TGuide S32全自動核酸提取儀，由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 引物合成 根據(jù)GenBank已公布的大腸桿菌通用16S rDNA基因序列以及氟喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類耐藥基因序列設(shè)計合成引物(表1)，用于大腸桿菌分離鑒定及耐藥基因分析，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR擴增的耐藥基因和毒力基因引物信息

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離與純化 在無菌條件下，取出臨床采集的肛門拭子，接種于麥康凱瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。用一次性無菌接種環(huán)挑取單個菌落，純化培養(yǎng)，觀察并記錄菌落形態(tài)、顏色等特征；挑取純化培養(yǎng)的菌落接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，觀察菌落形態(tài)、顏色等特征；用一次性無菌接種環(huán)挑取多個純化培養(yǎng)的菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，置37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)12 h后，取出進(jìn)行革蘭染色，并在顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 細(xì)菌的生化鑒定 在無菌條件下，取出純培養(yǎng)的細(xì)菌菌液，按照革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡說明書進(jìn)行操作，用VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行生化試驗鑒定。

1.2.3 16S rDNA基因的PCR擴增及測序 采用16S rDNA通用引物，按照購買的細(xì)菌DNA核酸提取試劑盒說明書，對純化好的細(xì)菌培養(yǎng)液進(jìn)行DNA提取，以提取好的基因組DNA為模板。PCR反應(yīng)體系： DNA模板5 μL，上游引物(10 μM)0.5 μL，下游引物(10 μM)0.5 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，超純水6.5 μL，總反應(yīng)體積25 μL。循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，共 35 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取出PCR產(chǎn)物5 μL，在1%瓊脂糖凝膠電泳上電泳檢查結(jié)果，預(yù)期擴增片段長約1 500 bp。將擴增產(chǎn)物交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。根據(jù)測序獲得的序列結(jié)果與GenBank中大腸桿菌參考株的基因進(jìn)行同源性比較。

1.2.4 大腸桿菌致瀉型檢測 以提取好的基因組DNA為模板，按照“5種致瀉型大腸桿菌核酸檢測試劑盒”產(chǎn)品說明書要求配制反應(yīng)體系，通過QuantStudio7 Flex熒光定量PCR儀進(jìn)行試驗，對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，判斷37-Canine株是否具有致病性。

1.2.5 藥敏試驗 無菌環(huán)境下，取出純培養(yǎng)的細(xì)菌菌液，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂表面，待菌液吸收后，選取目前北京市地區(qū)動物醫(yī)院臨床常用的8種抗菌藥：多黏菌素B 300 IU/片、慶大霉素120 μg/片、阿莫西林10 μg/片、頭孢曲松30 μg/片、頭孢噻肟30 μg/片、氨芐西林10 μg/片、諾氟沙星10 μg/片、磺胺嘧啶300 μg/片，采用K-B紙片擴散法，37 ℃ 培養(yǎng)24 h；觀察抑菌圈大小，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈大小判斷耐藥性。

1.2.6 四類耐藥基因檢測 以提取好的基因組DNA為模板，分別對氟喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類耐藥基因進(jìn)行PCR試驗。

PCR反應(yīng)體系：DNA模板5 μL，上游引物(10 μM)1 μL，下游引物(10 μM)1 μL，2×TaqPCR Master Mix 25μL，超純水6.5 μL，總體積50 μL。循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性35s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取出PCR產(chǎn)物5μL，在1%瓊脂糖凝膠電泳上電泳檢查結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離與純化 37-Canine株在麥康凱培養(yǎng)基上出現(xiàn)玫瑰紅、圓形、光滑、隆起、濕潤、邊緣不整齊的菌落；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上出現(xiàn)具有金屬光澤的圓形、光滑、隆起、邊緣規(guī)則的菌落。革蘭染色結(jié)果為陰性，顯微鏡下觀察呈現(xiàn)短桿狀結(jié)構(gòu)，兩端鈍圓，散在存在的陰性桿狀菌。

2.2 細(xì)菌的生化鑒定 生化試驗結(jié)果見表2。 37-Canine株不能分解D-麥芽糖，能分解D-葡萄糖、D-甘露醇，吲哚呈陽性，不產(chǎn)生H2S。經(jīng)VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定為大腸桿菌，評定結(jié)果為合格率99.9%。

表2 分離菌株的生化鑒定結(jié)果

+: 陽性; -:陰性

2.3 16S rDNA基因的PCR擴增及測序 對37-Canine株大腸桿菌PCR擴增后進(jìn)行電泳試驗，得到了約1 500 bp的目標(biāo)片段(見圖1)。37-Canine株擴增序列與GenBank中大腸桿菌參考株基因序列的同源性達(dá)到99%。通過與參考株的16S rDNA基因序列比對后構(gòu)建進(jìn)化樹(見圖2)，發(fā)現(xiàn)37-Canine株與AP018488.1參考株被劃為一支，說明該兩菌株間的同源性較高。

圖1 細(xì)菌的16S rDNA基因擴增圖譜
M: DL-2 000 DNA Marker； 1: 37-Canine株

圖2 分離菌16S rDNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 大腸桿菌致瀉型檢測結(jié)果 5種致瀉型大腸桿菌熒光PCR結(jié)果表明，37-Canine株含有的ipaH、lt、stp(stla)、sth(stlb)基因；stx1、stx2基因檢測陽性；pic基因檢測陽性。綜合判定37-Canine株為EIEC-EPEC-EHEC的雜合型大腸桿菌菌株，具有致瀉性，屬致病性大腸桿菌。

2.5 藥敏試驗 結(jié)果見表3。37-Canine株對頭孢曲松鈉、頭孢噻肟、諾氟沙星3種藥物敏感；對多黏菌素B、慶大霉素2種藥物中度敏感；對阿莫西林、磺胺嘧啶、氨芐西林3種藥物耐藥。

表3 分離菌株的藥敏試驗結(jié)果

S：敏感，抑菌環(huán)直徑>15 mm; I：中度敏感，抑菌圈直徑為 10～15 mm; R：耐藥，抑菌圈直徑為 0～10 mm

2.6 耐藥基因檢測 耐藥基因檢測結(jié)果(見圖3～圖6)。PCR試驗擴增出與aadA、aacC2、tetA、tetB預(yù)期大小一致的條帶，37-Canine株不攜帶氟喹諾酮類耐藥基因，攜帶氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類耐藥基因，最終表明37-Canine株對多種抗菌藥物耐藥。

圖3 氟喹諾酮類耐藥基因的檢測結(jié)果
M: DL-100 DNA Marker； 1:qnrA； 2:qnrB； 3:aac(6′)-Ib

3 討論

大腸桿菌是自然界廣泛存在的一種菌株，不同宿主來源或非致病性與致病性菌株間，基因組差異大，由此致病性等生理特性各不相同，參與腹瀉疾病的大腸桿菌菌株是腹瀉的各種病因中最重要的一種。致病性大腸桿菌為人獸共患病原菌，不同國家的寵物源性大腸桿菌的耐藥性差別較大。據(jù)報道，澳大利亞的犬源大腸桿菌除氨芐西林和四環(huán)素外，大多數(shù)分離株對所有測試的抗生素都敏感。丹麥、西班牙和瑞典等國家的犬源大腸桿菌對氨芐西林、磺胺類藥物、四環(huán)素等藥物耐藥性較高，對頭孢菌素、氟喹諾酮類藥物相對較敏感[4]。在本試驗中，37-Canine株攜帶氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類耐藥基因，對頭孢曲松鈉、頭孢噻肟、諾氟沙星3種藥物敏感；多黏菌素B、慶大霉素2種藥物中度敏感；阿莫西林、磺胺嘧啶、氨芐西林3種藥物耐藥。說明北京市地區(qū)犬源大腸桿菌的耐藥性也比較嚴(yán)重。因此，在寵物犬臨床腹瀉病例治療過程中，需要合理使用抗生素，尤其是在菌株出現(xiàn)中度敏感且又存在相關(guān)藥物耐藥基因趨勢時要慎重考慮。

圖4 氨基糖苷類耐藥基因的檢測結(jié)果
M:DL-100 DNA Marker；1:ahpA3； 2:aacC4； 3:aadA； 4:aacC2

圖5 四環(huán)素類耐藥基因的檢測結(jié)果
M:DL-100 DNA Marker； 1:tetA； 2:tetB

圖6 氯霉素類耐藥基因的檢測結(jié)果
M:DL-100 DNA Marker； 1:catI； 2:floR； 3:cm1A

目前，伴侶動物耐藥菌產(chǎn)生與流行的問題已得到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[5]，伴侶動物的抗生素的使用與人類使用抗生素治療疾病的使用有諸多的相同點。伴侶動物耐藥菌的形成與人耐藥菌的形成存在共性，耐藥基因在寵物犬和人類之間傳播的報道也日益增多[6]。大量研究表明，我國動物源性細(xì)菌抗生素耐藥情況比國外更為嚴(yán)重，抗生素使用和細(xì)菌耐藥性發(fā)生和傳播存在直接因果關(guān)系[7]。目前北京地區(qū)動物醫(yī)院臨床醫(yī)師存在有病亂用藥、聯(lián)合用藥、用藥劑量過大、用藥沒有針對性等原因誘發(fā)伴侶動物細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。本文通過對37-Canine株大腸桿菌耐藥性的檢測，今后積極開展寵物源性細(xì)菌耐藥性監(jiān)測，定期歸納總結(jié)耐藥趨勢，對防治北京市地區(qū)寵物源性細(xì)菌疾病臨床藥物使用提供有效的依據(jù)。