蘇布登格日勒 ， 溫婧怡 ，張 曼 ， 金 鑫 ， 王云鶴 ， 魏 方 ， 楊銀鳳

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

據(jù)報(bào)道，全球每年僅因奶牛乳腺炎造成的經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)350億美元，我國每年因奶牛乳腺炎造成的經(jīng)濟(jì)損失也達(dá)15億人民幣[1]。奶牛乳腺炎是由革蘭陰性菌和陽性菌以及真菌引起的在奶牛中最常見也是最有經(jīng)濟(jì)破壞力的疾病，對產(chǎn)奶質(zhì)量和數(shù)量都有較大影響[2]。而在獸醫(yī)治療過程中使用抗生素和牲畜淘汰仍為治療奶牛乳腺炎的主要手段。但也由于乳腺炎治療過程中抗生素的大量使用對牛奶質(zhì)量造成了顯著影響，如乳制品中抗生素殘留，會(huì)對飲用這類問題牛奶的人造成生理傷害，從而造成更大范圍內(nèi)的經(jīng)濟(jì)損失。到目前為止，盡管奶牛乳腺炎已經(jīng)得到了較為有效的控制，但它仍是現(xiàn)階段全球乳業(yè)所面臨的主要挑戰(zhàn)之一。

乳腺炎致病因素非常多，主要原因還是與環(huán)境和生物體自身遺傳免疫有關(guān)[3]。幾個(gè)世紀(jì)以來物種之間易感性的暴露，使得包括天然免疫在內(nèi)的第一道免疫防線經(jīng)過不斷篩選變得更加適合自然環(huán)境生存。而防御素就是生物在長期不斷進(jìn)化中保留的天然免疫中重要組成成分之一。防御素廣泛分布于植物以及脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物，根據(jù)其二硫鍵和半胱氨酸位置分為α、β和θ-防御素[4]。

作為防御素家族主要成員的β-防御素，是一種富含半胱氨酸的陽離子抗微生物肽[5]。有研究表明，這種半胱氨酸可以保護(hù)肽不被消化[6]。近年來發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物β-防御素的免疫調(diào)節(jié)作用可以調(diào)節(jié)炎癥和激活免疫系統(tǒng)。目前在牛體內(nèi)只發(fā)現(xiàn)了β-防御素[7]。而β-防御素也恰恰是牛發(fā)生乳腺炎感染之后除了天然性物理免疫屏障之外，最易產(chǎn)生有效防御的物質(zhì)。

1 牛β-防御素

1.1 牛β-防御素研究發(fā)現(xiàn)過程 牛β-防御素包括舌抗微生物肽(Lingual antimicrobial peptide，LAP)，牛嗜中性粒細(xì)胞β-防御素(Bovine neutrophil β-defensins，BNBD)，氣管抗微生物肽(Tracheal antimicrobial peptide，TAP)以及腸道β-防御素(Enteric β-defensin，EBD)[8]。第一種牛防御素是由Diamond等人從牛呼吸道中分離出來，并被命名為TAP[9]。Selsted在1993年報(bào)道發(fā)現(xiàn)了13個(gè)牛β-防御素序列[10]。2004年， Roosen等人報(bào)道了18個(gè)牛防御素基因，其中還包括6個(gè)新發(fā)現(xiàn)的β-防御素基因(DEFB401、DEFB402、DEFB403、DEFB404、DEFB405和LAP like)[11]。隨后研究者對牛的各種β-防御素進(jìn)行了聚類分析，結(jié)合人、黑猩猩、老鼠、大鼠和狗上已公布的防御素特征性數(shù)據(jù)，在牛的第8、13、23、27號(hào)染色體上共鑒定出58個(gè)基因，分別命名為A簇、B簇、C簇和D簇。其中A簇基因最少，D簇有重要的免疫基因，B簇和C簇的防御素基因在生殖道中表達(dá)[12]。研究表明，位于27號(hào)染色體上的基因可以抵抗乳腺炎。綜合對人、狗、黑猩猩、大鼠和小鼠的線性分析，發(fā)現(xiàn)27號(hào)染色體D簇上有30個(gè)基因，其中11個(gè)特定屬于牛，包括TAP、LAP、EAP、DEFB4A、DEFB5、BNBD7、BNBD10、BNBD10A、BNBD11、BBD403和BBD1[13]。本文聚焦于在乳腺和乳體細(xì)胞中表達(dá)的可以作為乳腺炎抵抗力標(biāo)記的β-防御素。

1.2 與牛乳腺炎有關(guān)的β-防御素研究發(fā)現(xiàn)過程

1.2.1 LAP LAP首先在炎性鱗狀上皮細(xì)胞中分離獲得[14]。然而除了舌上皮細(xì)胞，被感染的腸、呼吸道組織和乳腺上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有LAP表達(dá)。在母牛乳腺中就報(bào)道了有關(guān)LAP mRNA的表達(dá)，文章描述了乳汁中體細(xì)胞計(jì)數(shù)(Somatic cell count， SCC)與LAP mRNA表達(dá)和乳腺組織上皮細(xì)胞中mRNA定位之間的正相關(guān)關(guān)系[15]。但到目前為止尚無研究表明乳腺中存在LAP蛋白。因此，有研究者使用兔子做免疫組化試驗(yàn)，結(jié)果表明，LAP在健康的肺泡上皮細(xì)胞和乳汁中表達(dá)[16]。同時(shí)有多項(xiàng)研究表明，LAP是由肺泡上皮細(xì)胞分泌到乳汁中，并且對大腸桿菌有抗微生物活性。研究者在探索牛乳中LAP與乳腺炎、乳牛乳房內(nèi)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞膜成分對牛乳中LAP濃度的變化的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，SCC在LPS刺激后2 h開始增加，并保持其高水平直到第5天；乳汁中LAP濃度在LPS 刺激2 h后顯著升高，并維持2 d的較高水平[16]。有研究證明，牛奶中的LAP濃度與SCC之間存在顯著相關(guān)性[17]。這些結(jié)果表明，一些細(xì)菌成分可以刺激β-防御素分泌到牛奶中。

然而，在Swanson等人的研究中，在注入乳房鏈球菌野生菌株感染乳腺后，對乳房周圍和外部組織進(jìn)行分析，以及Roosen等人研究了臨床診斷為乳腺炎的外部和實(shí)質(zhì)器官，都表明LAP僅在感染牛中表達(dá)。值得注意的是牛的飲食類型也影響著LAP在乳房中的表達(dá)水平，根據(jù)報(bào)道，高濃縮飼料可以提高LAP表達(dá)水平[18]。根據(jù)LAP和SCC之間的顯著相關(guān)性可以判斷在感染了金黃色葡萄球菌、牛鏈球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌的牛乳之中LAP表達(dá)量比未感染的更高[19]。根據(jù)這些基礎(chǔ)研究，LAP被確定為牛乳腺炎關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記之一。

1.2.2 TAP TAP是首個(gè)從哺乳動(dòng)物氣管黏膜分離出的β-防御素[5]。TAP前原肽有64個(gè)氨基酸，包含20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和1個(gè)短的前序列(FTQGVG)。TAP還可以被多種病原體以及促炎因子，例如TNF-α、IL-1β 和LTA( Lipoteichoic acid )誘導(dǎo)。除此之外，LPS也可以增加TAP表達(dá)水平。根據(jù)報(bào)道它在健康和感染牛的乳腺細(xì)胞中都有表達(dá)，不僅如此，TAP在體外感染金黃色葡萄球菌的牛黏膜上皮細(xì)胞中也有表達(dá)[20]。

1.2.3 DEFB1 DEFB1 mRNA在感染的泌乳組織和非泌乳組織中存在，且在乳腺組織中呈現(xiàn)誘導(dǎo)性表達(dá)。DEFB1V1和DEFB1V2是BNBD1的兩個(gè)變體，是乳腺感染后誘導(dǎo)表達(dá)的防御素之一[21]。

1.2.4 DEFB4 DEFB4也被稱之為BNBD4，在1993年被首次報(bào)道牛肺泡組織中有較高水平的表達(dá)，但在小腸組織中表達(dá)水平較低[10]。一項(xiàng)研究表明，感染金黃色葡萄球菌后DEFB4在乳腺泡和乳池中呈現(xiàn)高水平表達(dá)[22]。DEFB4內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)部分單核苷酸多肽被發(fā)現(xiàn)與乳汁成分性狀和SCC有關(guān)，因此，DEFB4可以確定作為乳腺炎抵抗力的標(biāo)記。有研究證明，當(dāng)細(xì)菌感染牛乳腺細(xì)胞后就會(huì)激活奶牛巨噬細(xì)胞內(nèi)的維生素D通路，隨后1，25-二羥基維生素D3的活性激素刺激牛單核細(xì)胞的一氧化氮和β-防御素，使DEFB4表達(dá)水平提高[23]。

1.2.5 DEFB5(BNBD5) DEFB5與DEFB4類似，在牛肺泡表面巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)高水平表達(dá)[24]。研究表明，奶牛感染乳房炎時(shí)BNBD5的mRNA表達(dá)水平升高?；加腥榉垦椎娜橄俳M織中BNBD5表達(dá)量比平時(shí)升高約13倍[25]。另一個(gè)研究證明，在乳腺感染金黃色葡萄球菌時(shí)DEFB5表達(dá)水平比DEFB4的更高。同樣的，凝固酶陽性葡萄球菌對乳腺中DEFB5的表達(dá)水平的影響高于凝固酶陰性葡萄球菌，不同的是DEFB4在泌乳早期也呈現(xiàn)這種高水平表達(dá)[26]。但遺憾的是，關(guān)于BNBD5的研究中目的蛋白的大量獲得和最終有明顯抑菌作用的純化蛋白研究報(bào)道較少。

1.2.6 DEFB10 相比較而言，感染凝固酶陽性葡萄球菌的乳腺組織第1～2次泌乳中DEFB10的表達(dá)水平比第3～4次泌乳更高[25]。而DEFB1、DEFB4、LAP和DEFB5在第3～4次泌乳表達(dá)水平更高[25]。此外研究表明，乳汁中嗜中性粒細(xì)胞在經(jīng)過LPS處理后，DEFB10基因表達(dá)也出現(xiàn)升高現(xiàn)象[27]。

1.2.7 DEFB103 DEFB103是在27號(hào)染色體上新發(fā)現(xiàn)的β-防御素，它與D簇上其他的β-防御素幾乎沒有同源性，對于它在牛上的表達(dá)研究極少。根據(jù)文獻(xiàn)記載DEFB103多態(tài)型的四種單倍體與金黃色葡萄球菌引起的乳腺炎的耐藥性和易感性并沒有顯著關(guān)聯(lián)[28]。

2 牛β-防御素的作用機(jī)制

近年來，不管人還是動(dòng)物體內(nèi)，多重耐藥性和抗生素耐藥性已成為趨勢。但有趣的是，防御素并沒有這方面現(xiàn)象，其中一個(gè)可能存在的原因就是防御素在該位置只有少量存在或者一般情況下防御素為隱形存在，當(dāng)?shù)竭_(dá)作用部位時(shí)才發(fā)揮作用[29]。根據(jù)報(bào)道，β-防御素作為兩親性陽離子肽，對于革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、病毒、真菌和其他單細(xì)胞寄生蟲可以作為抗微生物肽(Antimicrobial peptides，AMPs)發(fā)揮作用[30]。

起初，肽通過靜電吸引力或者由膜上存在的受體介導(dǎo)與病原體的膜相互作用，在抗微生物肽達(dá)到閾值濃度后使細(xì)胞透化，隨后肽的構(gòu)像轉(zhuǎn)變。而在某些情況下，膜帶負(fù)電荷時(shí)這種相變才是可行的。這也再次指出防御素區(qū)分宿主細(xì)胞和靶向細(xì)胞的能力[31]。透化之后開始最初的結(jié)合和相互作用。

3 牛β-防御素的應(yīng)用展望

在乳腺炎防治中β-防御素的使用可以提高飼養(yǎng)奶牛動(dòng)物福利以及減少農(nóng)民飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)成本。研究關(guān)于奶牛乳腺炎的β-防御素對社會(huì)具有相當(dāng)重要的實(shí)用價(jià)值，可以為奶牛乳腺炎防治提供新思路，從而促進(jìn)全球奶牛養(yǎng)殖的健康發(fā)展。

3.1 調(diào)整飲食從而對β-防御素表達(dá)產(chǎn)生影響 營養(yǎng)物質(zhì)對個(gè)體免疫系統(tǒng)有較大的影響，但就β-防御素來說，不同膳食條件下宿主防御肽(Host defense peptides，HDPs)不同。對于人類，膳食組蛋白脫乙酰酶抑制劑蘿卜硫素和丁酸鈉被報(bào)道用來上調(diào)HDPs人類β-防御素-2在Caco-2、HT-29和SW480的表達(dá)。在感染大腸桿菌的仔豬，丁酸鈉促進(jìn)HDPs的高表達(dá)，并且在此水平下大腸桿菌數(shù)量降低[32]。因此，飲食本身有助于更好地抵抗乳腺炎，降低醫(yī)療費(fèi)用。

3.2 建立肽庫加速防御素發(fā)展應(yīng)用 牛β-防御素種類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多，我們可以進(jìn)一步利用其生物信息建立肽庫來全面快速發(fā)展防御素在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

3.3 根據(jù)防御素標(biāo)記挑選優(yōu)勢奶牛品種 根據(jù)前人研究可知，β-防御素可以作為乳腺炎關(guān)聯(lián)遺傳標(biāo)記，并根據(jù)此標(biāo)記對奶牛品種進(jìn)行人工篩選，選出對乳腺炎抵抗力強(qiáng)的品種進(jìn)行人工繁育。從而達(dá)到乳腺炎優(yōu)勢品種對抵抗力較弱的品種的替代。從而減少奶?；既橄傺赘怕剩罱K達(dá)到減少經(jīng)濟(jì)損失的目的。

3.4 替代抗生素 抗生素作為迄今為止治療乳腺炎的主要手段仍存在重復(fù)使用和不當(dāng)使用的問題，導(dǎo)致近年來抗生素使用效力大幅降低。因此，在未來乳腺炎的治療中可以考慮利用宿主對抗感染過程中激發(fā)的天然免疫所產(chǎn)生的β-防御素作為未來治療β-防御素的一個(gè)潛在工具。因?yàn)檫@些防御素的靶向目標(biāo)是微生物的整體結(jié)構(gòu)，并且它們是通過調(diào)節(jié)免疫結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用[33]。故微生物并沒有對β-防御素產(chǎn)生耐藥性。另一個(gè)原因就是β-防御素特異性強(qiáng)，廣泛分布于體內(nèi)，更有益與其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。

3.5 作為佐劑改善疫苗 乳腺預(yù)防疫苗是國內(nèi)外時(shí)下的討論熱點(diǎn)，而β-防御素是疫苗佐劑的理想候選物。目前對于人類和禽類的β-防御素作為疫苗佐劑方面研究較多，但在奶牛方面還有較大的研究空白，仍需我們積極研究探索。牛β-防御素的肽可以刺激Th1和Th2應(yīng)答以及傳遞免疫佐劑[34]。Mackenzie-Dyck等人表明牛皰疹病毒1疫苗就由BNBD3和糖蛋白D作為佐劑制備的[35]。