劉國曉 ， 劉 杰 ， 劉維康

(1. 泌陽縣中等職業(yè)技術(shù)學(xué)校 ， 河南 泌陽 463700 ; 2.洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司 ， 河南 洛陽 471000)

副豬嗜血桿菌為豬呼吸道的一種常見細菌，革蘭染色為陰性菌，有15個以上的血清型。某些高毒力或中等毒力血清型的副豬嗜血桿菌可引起副豬嗜血桿菌病，又稱多發(fā)性漿膜炎或格氏病。實驗室分離該菌可采集病豬肺臟、關(guān)節(jié)液、氣管黏液、腦組織等病料，分別接種胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)和血瓊脂，菌落特點為無色透明、光滑濕潤。挑取單菌落進行氧化酶和接觸酶試驗，結(jié)果為氧化酶陰性，接觸酶陽性。再加上該菌的常規(guī)生化鑒定的結(jié)果，可作為快速鑒定副豬嗜血桿菌的初步判斷標(biāo)準(zhǔn)，依照此方法可以快速篩選出副豬嗜血桿菌。

1 材料與方法

1.1 病料來源 病死豬來自河南某豬場，病豬出現(xiàn)呼吸困難、消瘦等癥狀，無菌取肺臟樣品。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)，購自青島海博試劑有限公司；革蘭染色試劑， 購自北京索萊寶科技有限公司 ； DNATaq酶、dNTPs、DNA Marker等，均購自寶生物工程(大連)有限公司；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 細菌分離 無菌采取病死豬肺臟，分別接種于血平板和添加血清及輔酶的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基， 37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個菌落進行純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后菌株進行革蘭染色鏡檢和常規(guī)細菌生化試驗。

1.4 細菌鑒定和血清型分型 根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA基因，張盼峰等[1]設(shè)計了1對特異性引物，引物序列為：P1:5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′,P2：5′-GTGATGAGGAAGGGTGT-3′,擴增出目的片段大小為821 bp，引物由英濰捷基(北京)有限公司合成。

PCR采用25 μL反應(yīng)體系，即10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP 2.0 μL、DNATaq酶0.5 μL，P1/P2引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 16.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并測序。

測序結(jié)果用DNASTAR軟件處理，并與NCBI中已發(fā)表的基因序列進行同源性比較，選取同源性最高菌株的基因序列，采用DNASTAR-MEGALIGN軟件進行多重序列比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

副豬嗜血桿菌血清型鑒定，參照Kate J.Howell等[2]報道提供的引物進行合成。

1.5 衛(wèi)星試驗 取1塊沒有添加輔酶的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，在平板中間直線接種金黃色葡萄球菌，然后將可疑菌落垂直金黃色葡萄球菌線劃線接種，37 ℃培養(yǎng)24 h。結(jié)果出現(xiàn)靠近金黃色葡萄球菌線的菌落長勢較好，遠離金黃色葡萄球菌線的地方無菌落生長的衛(wèi)星現(xiàn)象。

1.6 藥敏試驗 挑取疑似單個菌落接種于TSA+血清培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)5-6 h，取100 μL均勻涂布于含TSA+血清培養(yǎng)基上。用紙片瓊脂擴散法(K-B法)[3]進行藥敏試驗，選取頭孢噻呋、阿莫西林、甲砜霉素、硫酸黏菌素、阿米卡星、恩諾沙星、卡那霉素、慶大霉素、多西環(huán)素和氟苯尼考為試驗藥物，37 ℃培養(yǎng)16-18 h后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小，根據(jù)說明書敏感和耐藥性的最小抑菌圈直徑判定菌株對所選藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離 肺臟樣品在平板上的菌落較純，均為革蘭染色陰性桿菌，呈明顯的多形性。

2.2 衛(wèi)星試驗 分離株在靠近金黃色葡萄球菌直線處生長較好，而遠離直線的地方基本沒有細菌生長。

2.3 分子鑒定 取單個純化且具有典型特點的菌落進行PCR鑒定，并設(shè)陽性和陰性對照，陽性對照電泳結(jié)果條帶大小為820 bp左右，樣品條帶大小也為820 bp左右，陰性對照無條帶，結(jié)果見圖1和圖2，目的菌與Haemophilus parasuis strain CCUG_3712同源性為98.0%，說明該菌株為副豬嗜血桿菌。經(jīng)鑒定為副豬嗜血桿菌后，取單個菌落進行血清型PCR鑒定，鑒定結(jié)果為血清4型。

圖1 PCR擴增結(jié)果
M:DL-2 000 ； 1:陰性對照 ； 2:陽性對照 ； 3:樣品

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹
▲ : 分離毒株

2.4 藥敏試驗 分離到的細菌對頭孢噻呋、甲砜霉素、硫酸黏菌素、阿米卡星、恩諾沙星、卡那霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考高敏；對阿莫西林耐藥，如表1。

表1 分離株藥敏試驗結(jié)果

S:敏感；R:耐藥

3 討論

本次實驗室細菌分離檢測結(jié)果為4型副豬嗜血桿菌，在該豬場不同批次和不同圈舍中同樣檢測到4型副豬嗜血桿菌。細菌的臨床檢測要對臨床癥狀進行判斷，從而發(fā)現(xiàn)能夠引起此癥狀的細菌。在養(yǎng)殖場普遍使用抗生素的情況下，對病料的完整性和細菌的分離會有影響。目前實驗室細菌初步鑒定的方法主要是革蘭染色和選擇性平板，最后通過PCR結(jié)果進行確定。副豬嗜血桿菌的感染意味豬群的免疫力的下降，這種疫病的發(fā)生說明該豬場可能存在免疫抑制性疾病或者管理方面的問題[4]。副豬嗜血桿菌不同的血清型之間對藥物的敏感程度存在差異，所以臨床用藥要根據(jù)所分離到的細菌的藥敏試驗結(jié)果來采取有針對性的用藥。隨著國家對抗生素使用的逐步限制，養(yǎng)殖場對細菌病的防控主要以預(yù)防和環(huán)境控制為主，細菌病的預(yù)防需要對養(yǎng)殖場流行毒株進行了解，細菌病的預(yù)防難點是不同血清型的毒株基本沒有交叉保護性，需要養(yǎng)殖場建立完善的監(jiān)控體系，及時更新疫苗毒株。