李存法 ， 王瑞寧 ， 李華瑋 ， 馮麗麗 ， 張二芹 ， 張 雅 ， 何 健 ， 趙孟孟

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046 ； 2. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046 ；3. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所 ， 河南 鄭州 450002 ； 4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 ，河南 鄭州 450002 ; 5.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院 ， 廣東 佛山 528000 )

豬繁殖與呼吸綜合征是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引發(fā)的一種烈性，高度接觸性傳染病，臨床癥狀主要是流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎以及各種呼吸道癥狀。該病在我國(guó)于1986年首次報(bào)道，之后全國(guó)流行，2006年暴發(fā)，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失，已成為養(yǎng)豬業(yè)頭號(hào)危害。由于該病毒是RNA病毒，變異速度快，一直未有有效的疫苗和藥物防控該病。

2′,5′-寡腺苷酸合成酶是干擾素刺激產(chǎn)生的一種具有抗病毒活性的干擾素促進(jìn)基因，最初于1976年報(bào)道。病毒感染后產(chǎn)生的IFN能使細(xì)胞內(nèi)2′,5′-寡腺苷酸合成酶蛋白量增加上千倍，2′,5′-寡腺苷酸合成酶通過活化RNase L酶引發(fā)病毒和細(xì)胞的RNA發(fā)生降解，從而殺死病毒及其感染的細(xì)胞[1-2]。該蛋白在人，豬，牛等多種動(dòng)物身上都有分布[3-6]。豬寡腺苷酸合成酶家族主要包括OAS1a，OAS1b，OAS2，OASL，其中豬OAS1a有報(bào)道具有抗病毒效果[7]，檢測(cè)OAS1a的表達(dá)情況有利于檢測(cè)機(jī)體的免疫特征，為分析機(jī)體病毒感染情況，以及免疫調(diào)控與免疫逃逸提供參考[8-11]。

針對(duì)豬2′,5′-寡腺苷酸合成酶的檢測(cè)方法一直未見報(bào)道，本研究通過熒光定量方法建立一種檢測(cè)豬OAS1a表達(dá)量的方法，為臨床檢測(cè)免疫特征提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 PAM細(xì)胞為農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 病毒 PRRSVCH-1R病毒為農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 試劑 RNA提取試劑TRIZol，購(gòu)自Life Technology公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RT reagent Kit；with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、pMD18-T載體、SYBER 熒光定量預(yù)混劑，PCRExTaq酶預(yù)混劑,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Poly(I ∶C),購(gòu)自Invivogen公司;干擾素,購(gòu)自Pepro-Tech公司;無(wú)病原菌豬的臟器：心、肝、脾、肺、腎、腦、淋巴結(jié)、腸為農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞培養(yǎng)用1640和胎牛血清,購(gòu)自GIBCO公司;含有IRF3、IRF7、 RIG-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 主要儀器： PCR儀器,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;熒光定量?jī)x器7500，購(gòu)自ABI公司。

1.5 方法

1.5.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)豬寡腺苷酸合成酶OAS1a基因的序列設(shè)計(jì)定量引物，其中上游引物序列為：5′-TATGAATTCAATGGGAAACTGGGGGTCCC-3′，下游引物為：5′-CGCGACGACTCAGTCCATGAATCTCC-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 從PAM細(xì)胞以及豬的各種組織提取RNA，RNA提取步驟以及反轉(zhuǎn)錄步驟參照試劑盒步驟，具體參照文獻(xiàn)[12]。

1.5.3 PCR反應(yīng)體系ExTaq酶預(yù)混劑25 μL，上下游引物(10 pm)各1 μL，模板2 μL，水21 μL，其他具體參照文獻(xiàn)[13]。

1.5.4 pMD18-T載體構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳之后，經(jīng)過膠回收試劑盒純化，連接pMD-18-T載體，4 ℃過夜連接，之后轉(zhuǎn)化，挑取單菌落，搖菌，提質(zhì)粒，具體步驟參照文獻(xiàn)[14]。

1.5.5 測(cè)序 菌液PCR鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.5.6 病毒感染 PAM細(xì)胞以2×105/孔的密度鋪在1640培養(yǎng)液中，以MOI=1的病毒劑量感染細(xì)胞，分別在不同時(shí)間點(diǎn)0 h，6 h，12 h，24 h，36 h，48 h收樣，提取RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.5.7 干擾素處理 PAM細(xì)胞以2×105/孔的密度鋪在1640培養(yǎng)液中，以1 000單位干擾素處理細(xì)胞，分別在不同時(shí)間點(diǎn)0，6，12，24，36，48 h收樣，提取RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.5.8 不同臟器組織取樣 將健康豬的不同組織：心、肝、脾、肺、腎，腦、腸、淋巴結(jié)，取樣，研磨處理，反復(fù)凍融之后提取總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.5.9 熒光定量反應(yīng) 熒光定量反應(yīng)體系為10 μL qPCR 預(yù)混劑，上下游引物各0.2 μL，模板2 μL，水13 μL，95 ℃ 預(yù)變性15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。

1.5.10 數(shù)據(jù)處理 所有樣品結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，計(jì)算拷貝數(shù)，用GraphPad Prism軟件制作圖表。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增曲線與敏感性結(jié)果 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒換算濃度之后計(jì)算拷貝數(shù)，倍比稀釋之后qPCR反應(yīng)生成擴(kuò)增曲線，結(jié)果可見曲線平滑，擴(kuò)增效果良好，結(jié)果見圖1。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明,該試驗(yàn)方法的1 000～1 000 000拷貝數(shù)均有擴(kuò)增，最低拷貝數(shù)100無(wú)擴(kuò)增曲線，最低敏感性為100拷貝，結(jié)果見圖2。

圖1 擴(kuò)增曲線

圖2 敏感性試驗(yàn)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果 在擴(kuò)增曲線生成之后，儀器自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3，該曲線重合率R2在98.9%，表明曲線重復(fù)性良好。

2.3 熔解曲線與特異性結(jié)果 qPCR反應(yīng)結(jié)束之后，儀器自動(dòng)生成熔解曲線，熔解曲線結(jié)果可見單峰，表明引物效果良好。將含有IRF3，IRF7， RIG-1 的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，除了含有OAS1a的目的質(zhì)粒有擴(kuò)增曲線以外，其余均未有擴(kuò)增，表明引物特異性良好。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 組織分布結(jié)果 將豬不同組織提取RNA之后進(jìn)行qPCR反應(yīng)，結(jié)果表明OAS1a基因在多個(gè)組織中均有分布，以肝臟和淋巴結(jié)最多。

2.5OAS1a在病毒感染過程中表達(dá)變化結(jié)果 將PRRSV病毒感染細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)采集細(xì)胞，收樣，測(cè)定拷貝數(shù)，結(jié)果表明,OAS1a基因在病毒感染過程中表達(dá)量逐步升高，36 h達(dá)到最高。

圖4 OAS 1a基因在不同組織中的分布

圖5 OAS 1a基因在PRRSV感染過程中的表達(dá)變化

2.6 干擾素處理細(xì)胞基因表達(dá)變化結(jié)果 干擾素處理細(xì)胞后，OAS1a基因表達(dá)量迅速升高，6 h達(dá)到最高，之后有所下降，結(jié)果見圖6。

圖6 OAS 1a基因在干擾素處理過程中的表達(dá)變化

干擾素誘導(dǎo)劑Poly(I ∶C)用同樣方法處理細(xì)胞之后，在4 h誘導(dǎo)期，該基因表達(dá)量也迅速升高，結(jié)果見圖7。

圖7 OAS 1a基因在Poly(I ∶C)處理過程中的表達(dá)變化

3 討論

2′,5′-寡腺苷酸合成酶蛋白(2′,5′-Oligoadenylate synthetase protein，OAS)是IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有抗病毒活性的一種ISG，該酶家族在IFN抗病毒過程中具有重要作用，同時(shí)也參與凋亡及生長(zhǎng)等其他細(xì)胞行為。病毒感染后產(chǎn)生的IFN能使細(xì)胞內(nèi)OAS蛋白量增加上千倍。在雙鏈RNA(dsRNA)活化后，OAS使ATP寡聚體化生成從二聚體到30聚體不等的2′-5′連接的寡腺苷酸(2-5A)。2-5A與RNase L緊密結(jié)合后，使得RNase L形成二聚體而被激活。在病毒感染的細(xì)胞中，RNase L引發(fā)病毒和細(xì)胞的RNA發(fā)生降解，從而殺死病毒及其感染的細(xì)胞。在人體細(xì)胞中，IFN能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生4種類型的OAS：小型的p42/p46 OAS(OAS1)、中型的p67/p71 OAS(OAS2)、大型的p100 OAS(OAS3)及類OAS蛋白p59(OASL)。小型的OAS也存在于哺乳類動(dòng)物中，人的p59蛋白(OASL)不具有合成2-5A的活性，鼠DC細(xì)胞中也存在同源的OASL蛋白。

在沒有IFN的情況下，大多數(shù)細(xì)胞或組織中OAS的濃度都非常低。在多數(shù)情況下，要分離OAS蛋白，就要用IFN對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行處理。2-5A最早出現(xiàn)在1978年，當(dāng)時(shí)它被描述為一種低分子量的蛋白合成抑制劑。之后，在IFN處理的細(xì)胞提取物及兔網(wǎng)狀細(xì)胞裂解液中，合成酶OAS(2-5A Synthetase)及雙鏈RNA依賴的蛋白激酶PKR同時(shí)被發(fā)現(xiàn)。1987年，Chebath等為2-5A系統(tǒng)(2′-5′-Oligoadenylate system；OAS system)參與IFN抗病毒效應(yīng)提供了最初的證據(jù)。

本試驗(yàn)建立了豬寡腺苷酸合成酶的熒光定量檢測(cè)方法，為首次報(bào)道。該方法簡(jiǎn)便，特異性好，并檢測(cè)到該基因在豬不同組織中的分布，證明肝臟和淋巴結(jié)中分布較多，原因可能是該組織主要是含有較多的免疫細(xì)胞，免疫反應(yīng)較強(qiáng)烈。另外證明干擾素處理之后，該基因大量表達(dá)，進(jìn)一步證明該基因是干擾素促進(jìn)基因。另外在PRRSV病毒感染過程中，該基因不斷升高，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。不同的是一個(gè)是蛋白水平，一個(gè)是mRNA水平，原因可能是病毒感染促進(jìn)了干擾素的表達(dá)，干擾素進(jìn)一步促進(jìn)該基因的表達(dá)，也從側(cè)面進(jìn)一步證明PRRSV感染可以激活干擾素這個(gè)結(jié)論。另外，推測(cè)其他病毒感染可能也會(huì)激活該基因的表達(dá)，預(yù)計(jì)該基因可以作為機(jī)體免疫反應(yīng)被激活的一個(gè)證明[16-19]。

已經(jīng)有報(bào)道，其他物種的OAS1a在病毒感染之后都有升高，如Tembusu virus[20]等病毒。在人體上該基因也被作為檢測(cè)機(jī)體免疫特征的檢測(cè)指標(biāo)，并且有商品化的ELISA檢測(cè)試劑盒，但是在動(dòng)物上還未有報(bào)道。

本試驗(yàn)建立的方法為檢測(cè)豬寡腺苷酸合成酶提供了參考，有利于檢測(cè)機(jī)體的免疫特點(diǎn)。