吳伯梅 ， 鮮思美 ， 饒體宇 ， 張 友 , 楊 倩 ， 包滔滔

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 ， 貴州 貴陽 550025 ； 2.貴州省動物疫病研究所 ， 貴州 貴陽 550025)

養(yǎng)鴨業(yè)在我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)中占有重要地位，隨著經(jīng)濟發(fā)展，傳統(tǒng)養(yǎng)鴨業(yè)結(jié)構(gòu)也在發(fā)生著很大的變化，即由農(nóng)村散養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)榧s化養(yǎng)殖。鴨場環(huán)境衛(wèi)生不達(dá)標(biāo)、地面潮濕、舍內(nèi)通風(fēng)不良、飼養(yǎng)密度過大等均是導(dǎo)致細(xì)菌性疾病發(fā)生的誘因，一旦發(fā)生疫病將給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失。預(yù)防性消毒是集約化養(yǎng)殖場防控細(xì)菌性疾病的重要措施之一，常見的消毒方法包括物理消毒、化學(xué)消毒及微生物消毒等，其中化學(xué)消毒法主要通過消毒劑熏蒸、噴灑和浸泡等方式殺滅病原微生物。本試驗選用市場常售的5種消毒劑對鴨場常見5種病原菌進(jìn)行殺滅效果觀察，對養(yǎng)殖場選擇消毒劑進(jìn)行有效消毒具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株 大腸桿菌、鴨疫里默桿菌、巴氏桿菌、沙門菌和葡萄球菌均由貴州省動物疫病研究所臨床分離鑒定及保存。

1.2 試劑 消毒劑：聚維酮碘、戊二醛癸甲溴銨(河南后裔實業(yè)集團有限公司)；苯扎溴銨(江西鵬創(chuàng)生物科技有限公司)；月芐三甲氯銨(西鄉(xiāng)長江動物藥品有限責(zé)任公司)；復(fù)方戊二醛(英國考文垂化學(xué)藥品有限公司)。培養(yǎng)基：LB肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂、瓊脂粉、脫纖維羊血、胰蛋白胨大豆肉湯、特級馬血清。中和劑：參照GB15982-2012醫(yī)院消毒標(biāo)準(zhǔn)配制消毒劑中和劑，聚維酮碘及月芐三甲氯銨配制0.5%硫代硫酸鈉溶液；苯扎溴銨配制0.3%吐溫-80+0.3%卵磷脂溶液；復(fù)方戊二醛(戊二醛+苯扎氯胺)及戊二醛癸甲溴銨(戊二醛+癸甲溴銨)配制3%吐溫-80+0.3%卵磷脂+0.3%甘氨酸。

1.3 菌液制備 將加入25%甘油保存的菌種解凍，采用分區(qū)劃線法在瓊脂平板中接種，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后得到單個菌落，挑取單個菌落進(jìn)行增菌，37 ℃恒溫培養(yǎng)18-24 h，平板計數(shù)法測定菌落總數(shù)，制備細(xì)菌懸液。

1.4 5種消毒劑對鴨場常見病原菌的MIC/MBC測定 參照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》檢測MIC/MBC，使用無菌標(biāo)準(zhǔn)硬水將各消毒劑稀釋成使用濃度的2倍，對該濃度進(jìn)行倍比稀釋。取稀釋好的消毒劑1 mL分別加入含1 mL雙倍營養(yǎng)肉湯的試管中混勻，再接入0.1 mL制備好的菌懸液混勻，標(biāo)記；陽性對照以營養(yǎng)肉湯加菌液為對照，陰性對照以營養(yǎng)肉湯及無菌標(biāo)準(zhǔn)硬水為對照，各樣本設(shè)2個平行對照，將試驗組、陽性對照組及陰性對照組放置37 ℃搖床中，培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)陽性對照管有細(xì)菌生長(混濁)，陰性對照管無菌生長(透明)，試驗組無菌生長的最高稀釋度所對應(yīng)的抗(抑)菌劑濃度，重復(fù)試驗3次，得到一致結(jié)果，即可判定該濃度為樣品對受試菌的MIC，試驗菌工作濃度為5×105CFU/mL～5×106CFU/mL。

在MIC 試驗觀察 24 h 后，往無菌生長的試管加入經(jīng)鑒定合格的中和劑 2 mL混勻，于 37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察是否有菌生長，將培養(yǎng)后的液體在營養(yǎng)瓊脂上進(jìn)行點種，無細(xì)菌生長的最大稀釋度即為該樣品對受試菌的MBC。

2 結(jié)果

通過營養(yǎng)肉湯稀釋法檢測5種消毒劑對鴨場常見病原菌的MICs/MBCs值，結(jié)果見表1、表2。由表1、表2可知，這5種消毒劑對病原菌的殺菌效果有明顯差別，聚維酮碘對同種受試菌的MICs/MBCs值均一致，對不同受試菌的MICs/MBCs值表現(xiàn)出2倍差異，苯扎溴銨對這5種病原菌的MICs/MBCs值分別為1∶200、1∶25；月芐三甲氯銨對這5種病原菌的MICs/MBCs值分別為1∶1 920、1∶960，復(fù)方戊二醛對這5種病原菌的MICs/MBCs值分別為1∶1 200、1∶600；戊二醛癸甲溴銨對這5種病原菌的MICs/MBCs值分別為1∶1 000、1∶500。

表1 5種消毒劑對鴨場常見病原菌的MICs值

表2 5種消毒劑對鴨場常見病原菌的MBCs值

3 討論

在養(yǎng)殖鴨子的環(huán)境中存在著大量微生物，一般情況下不會對鴨產(chǎn)生危害，但環(huán)境污染、圈舍濕冷、氣溫驟變等應(yīng)激導(dǎo)致鴨子抵抗力降低，常誘發(fā)細(xì)菌性疾病，病原菌隨排泄物、分泌物排到養(yǎng)殖環(huán)境中，造成地表、飼料及飲水等污染，鴨群通過消化道、呼吸道及傷口感染，導(dǎo)致細(xì)菌性疾病的發(fā)生與傳播，給養(yǎng)殖戶帶來嚴(yán)重經(jīng)濟損失。消毒是預(yù)防和控制細(xì)菌性疾病發(fā)生與流行的有效手段，常使用消毒劑消滅停留在不同傳播媒介上的病原體，通過切斷傳播途徑，以控制細(xì)菌性疾病的發(fā)生與傳播。

聚維酮碘主要通過釋放游離碘，作用于細(xì)菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)變性、沉淀，導(dǎo)致細(xì)菌死亡，廣泛應(yīng)用于黏膜、皮膚、器械、隱形眼鏡等消毒[1-3]。本試驗中聚維酮碘對病原菌的MICs/MBCs均低于廠家推薦使用濃度，根據(jù)周慶民等[4]研究影響聚維酮碘穩(wěn)定性的試驗中，發(fā)現(xiàn)有效碘含量會隨著存儲時間增加、溫度升高而減少，避光保存可減緩有效碘含量的下降速率，聚維酮碘中有效碘的含量與殺菌能力呈正相關(guān)，推測試驗使用的聚維酮碘中因保存不當(dāng)導(dǎo)致有效碘含量降低，從而表現(xiàn)出低的殺菌效果。

本試驗根據(jù)薛廣波等[5]方法在檢測苯扎溴銨MIC/MBC時，MICs/MBCs表現(xiàn)出8倍的差異，為了解導(dǎo)致苯扎溴銨對病原菌MIC/MBC差異大的原因，通過對苯扎溴安作用后的菌液進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)測定，發(fā)現(xiàn)苯扎溴銨在稀釋比為1∶25～1∶200時，試管中的顏色變化與陰性對照一致，但細(xì)菌濃度比工作濃度(5×105CFU/mL～5×106CFU/mL)低，表現(xiàn)出一定的抑菌作用，故判定苯扎溴安對病原菌的MIC為1∶200。

檢測這5種消毒劑對病原菌的MICs/MBCs值均低于廠家推薦使用濃度，按照廠家推薦使用濃度進(jìn)行消毒，不能對環(huán)境做到有效消毒，而戊二醛癸甲溴銨溶液按照廠家推薦的常規(guī)環(huán)境消毒稀釋比1∶2 000～1∶4 000，疫病發(fā)生時環(huán)境消毒稀釋比1∶500～1∶1 000，通過與檢測到的MICs/MBCs值相比，按照疫病發(fā)生時環(huán)境消毒的稀釋最大比進(jìn)行配制消毒劑，可對病原菌造成一定的殺滅效果。造成消毒劑對病原菌的MIC/MBC低于廠家推薦使用濃度的原因，可能是消毒劑保存不當(dāng)或病原菌對消毒劑產(chǎn)生耐藥性。因此，養(yǎng)殖廠在選擇消毒劑時，應(yīng)結(jié)合消毒劑對病原菌的殺滅效果，制定科學(xué)的消毒規(guī)程，對養(yǎng)殖場進(jìn)行有效消毒。