趙明旺 ， 張 君 ， 徐尚榮 ， 彭 巍 ， 舒 適 ， 黃 榮 ， 張琳欽 ， 關(guān)凱文

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院 ，青海 西寧 810016 ; 2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 ， 青海 西寧 810016)

生物節(jié)律指動物為了適應(yīng)環(huán)境，在生命活動中，從分子、細(xì)胞到機體等不同層次上都有明顯的時間周期現(xiàn)象[1]，包括近日節(jié)律和長日節(jié)律。而近日節(jié)律是最重要的一種生物節(jié)律，是以近似24 h為周期的自主維持振蕩器，主要受生物鐘基因的調(diào)控，包括Bmal1(Brainandmusclearnt-like1，Bmal1)，Clock(Circadianlocomotoroutputcycleskaput，Clock)、Per(Period，Per)和Cry(Cryptochrom，Cry)等。其中，Bmal1是調(diào)控節(jié)律基因的核心元件，能和Clock形成異二聚體，并與其他鐘基因(如Per、Cry等)啟動子區(qū)的E-box元件結(jié)合，驅(qū)動這些基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)生物體的生命活動。哺乳動物的生物鐘基因最早被定位于下丘腦視交叉上核(Suprachiasmatic nuclei，SCN)， 但隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)生物鐘基因在其他外周組織中也有表達(dá)[2-4]，說明生物鐘基因除了在生物節(jié)律中起作用外，在動物機體其他代謝中也發(fā)揮著重要的作用。研究指出，生物鐘基因在丘腦-垂體-性腺系統(tǒng)軸的組織中表達(dá)，參與調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育和功能[5-6]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，在卵泡合成孕酮的過程中，類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)和3β-羥化類固醇脫氫酶(3-βHSD)呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性表達(dá)，對其啟動子區(qū)的分析發(fā)現(xiàn)存在Bmal/Clock的作用靶點E-box[7]。Bmal1對動物黃體的形成和孕酮(P4)的分泌，甚至對動物的排卵周期以及胚胎發(fā)育都有影響[8-9]。這些研究說明生物鐘基因參與動物的生殖調(diào)控，對動物的繁殖有一定的影響。因此，研究生物鐘基因在動物生殖系統(tǒng)中的表達(dá)規(guī)律與功能，對畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

牦牛(Bosgrunniens)作為高原地區(qū)農(nóng)牧民的主要生活和生產(chǎn)資料，其所處的環(huán)境特殊，繁殖性能低下，近年來關(guān)于牦牛繁殖性能的研究頗多，但有關(guān)牦牛卵巢顆粒細(xì)胞中是否存在生物鐘基因尚未見有關(guān)報道。因此，本試驗以分離培養(yǎng)的母牦牛卵巢顆粒細(xì)胞為研究對象，分離培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞，運用免疫熒光對Bmal1蛋白表達(dá)進行定位，并用qRT-PCR技術(shù)檢測該基因在不同培養(yǎng)時間牦牛顆粒細(xì)胞中的表達(dá)情況，以確定Bmal1基因的節(jié)律性表達(dá)規(guī)律，為下一步研究Bmal1對牦牛顆粒細(xì)胞生物學(xué)功能的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 西寧市裕泰屠宰場健康母牦牛。用滅菌剪刀剪取卵巢，生理鹽水沖洗干凈，置于盛有36 ℃生理鹽水及雙抗的保溫杯中。

1.1.2 主要試劑 DMEM、10%胎牛血清，購自Gibico公司；地塞米松購自Sigma公司；TransZolUp Plus RNA Kit、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Bmal1兔多克隆抗體購自Abcam公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Green Premix，購自大連寶(TaKaRa)生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱，為美國Thermo產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡，為Nikon產(chǎn)品；核酸蛋白儀，為Thermo產(chǎn)品；普通PCR儀，為Eppendorf產(chǎn)品；電泳儀，為Hoefer公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，為天美(中國)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；qRT-PCR儀(QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System)，為Applied Biosystems產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的牦牛Bmal1(登錄號：XM_014477271.1)基因序列和內(nèi)參基因GAPDH(登錄號：XM_014482068.1)引物序列，利用Oligo7.0軟件設(shè)計熒光定量引物(見表1)。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 Bmal 1和GAPDH引物序列

1.2.2 牦牛卵巢顆粒細(xì)胞的分離 從屠宰場采集健康的牦牛卵巢，在2-6 h內(nèi)送回實驗室細(xì)胞間內(nèi)。剪掉卵巢上的結(jié)締組織，用生理鹽水清洗3次。吸取卵泡液于盛有5%胎牛血清(FBS)的15 mL離心管中，常溫離心5 min(1 200 r/min)，棄去上清液。用加有雙抗的PBS離心清洗重復(fù)5次。細(xì)胞篩過濾,得到較為純凈的牦牛顆粒細(xì)胞。

1.2.3 牦牛顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng) 將處理好的牦牛顆粒細(xì)胞按照適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度，在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別裝入細(xì)胞瓶中，于5%CO2，95%空氣，37 ℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h之后觀察細(xì)胞生長情況，棄掉原培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍，再換上新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后細(xì)胞長滿瓶底時，進行細(xì)胞傳代：棄掉原有培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，向每個細(xì)胞瓶中加入1 mL胰酶消化5 min后，等量的血清終止消化，吹打混勻離心(1 200 r/min，5 min)；向每管細(xì)胞沉淀中加入500 μL培養(yǎng)基，混勻，集中于15 mL離心管中，混勻，細(xì)胞計數(shù)；按照計數(shù)好的細(xì)胞濃度，平均分裝至35 mm平皿中，并加入1 mL培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)為每個平皿105個。

1.2.4Bmal1基因在顆粒細(xì)胞中的定位 當(dāng)原代細(xì)胞生長至平皿90%時，胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液，將4×105個/mL的細(xì)胞懸液注入放有8 mm圓形載玻片的35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞長至貼壁面近80%時，取出細(xì)胞爬片，用PBS沖洗3遍(1 min/遍)，4%多聚甲醛固定15 min，進行細(xì)胞免疫化學(xué)染色：PBS清洗3遍；0.4%Triton通透細(xì)胞膜10 min，隨后以即用型正常山羊血清封閉30 min，然后加入一抗(1∶200)，4 ℃孵育過夜；加入二抗羊抗兔IgG(H+L)(1∶100)，室溫避光1 h；最后加入1 mg/L的Hoechst33258，室溫5 min，熒光顯微鏡下觀察。同時用PBS代替一抗作陰性對照

1.2.5Bmal1基因節(jié)律性的體內(nèi)模擬試驗 傳代細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，根據(jù)文獻(xiàn)，地塞米松能夠模擬體內(nèi)節(jié)律性，本試驗向每個平皿中加入100 nM的地塞米松處理2 h[10]，棄掉原含有地塞米松的培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，換入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。從加入新的培養(yǎng)基開始，每隔4 h(4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)進行細(xì)胞收集并提取RNA。每個試驗設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.6 顆粒細(xì)胞RNA的提取和cDNA的合成 對顆粒細(xì)胞的總RNA進行提取，提取方法按照TransZolUp Plus RNA Kit試劑盒說明書進行。取6 μL提取的RNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，并用核酸蛋白儀檢測RNA濃度。cDNA合成各組RNA的量為700 ng，轉(zhuǎn)錄方法按照說明書進行。得到的cDNA分別作為常規(guī)PCR和qRT-PCR的模板，并放置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.7 常規(guī)PCR檢驗Bmal1引物的特異性 PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqMix 12.5 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 6.5 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 min，退火30 min(退火溫度見表1)，72 ℃ 30 min，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取5 μL擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂凝膠電泳進行試驗：電壓100 V，時間30 min。

1.2.8 qRT-PCR 分別檢測Bmal1在24 h內(nèi)不同時間點的表達(dá)量。反應(yīng)體系為20 μL：Premix 10 μL、Dye 0.4 μL、ddH2O 6 μL、上下游引物各0.8 μL、DNA模板2 μL；反應(yīng)條件參照產(chǎn)品說明書。每組試驗樣品重復(fù)4次試驗，每個樣品的目的基因和內(nèi)參基因GAPDH分管同板以相同條件擴增。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行處理。用余弦分析軟件進行基因的節(jié)律性分析，并獲取節(jié)律性參數(shù)。IBM SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組內(nèi)差異進行t檢驗，同組不同時間點的數(shù)據(jù)用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1Bmal1在牦牛顆粒細(xì)胞中的定位表達(dá) 對牦牛顆粒細(xì)胞進行免疫熒光染色，紅色為目的蛋白標(biāo)記，藍(lán)色為細(xì)胞核標(biāo)記。結(jié)果(見中插彩版圖1)顯示，體外培養(yǎng)細(xì)胞已經(jīng)貼壁，經(jīng)過免疫組化染色紅色標(biāo)記后得知，Bmal1蛋白在牦牛顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)分布。

圖1 Bmal1蛋白在牦牛顆粒細(xì)胞中的表達(dá)A：正常鏡下的顆粒細(xì)胞 ； B：目的蛋白熒光染色 ； C：細(xì)胞核染色 ； D：合并

2.2 牦牛卵巢顆粒細(xì)胞總RNA的提取 用核酸蛋白儀檢測提取的RNAOD260/OD280的比值均在1.8～2.0之間，說明RNA純度高。再經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，結(jié)果顯示，28S RNA和18S RNA條帶清晰可見(圖2)，說明提取的總RNA完整性強，無降解。兩者結(jié)果表明，提取的RNA均符合要求，可以用于后續(xù)試驗。

2.3 常規(guī)PCR檢驗引物的特異性 取5 μL擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗，電壓100 V，時間30 min，在瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)清晰觀察到在膠上119 bp和140 bp處均為單一條帶，說明引物特異性好并且與預(yù)期的片段長度是相符的(圖3)，引物可用于后續(xù)試驗工作。

圖2 總RNA提取結(jié)果
M：DNA標(biāo)準(zhǔn) DL-2 000 ； 1～3：牦牛卵巢顆粒細(xì)胞總RNA電泳圖

圖3 Bmal1和GAPDH的擴增結(jié)果
M：DNA標(biāo)準(zhǔn) DL-500 ； 1～2：Bmal1 ； 3～4：GAPDH

2.4Bmal1在顆粒細(xì)胞中不同時間段的表達(dá)量分析 地塞米松模擬試驗處理后，在體外培養(yǎng)24 h內(nèi)不同時間點Bmal1基因在顆粒細(xì)胞的相對表達(dá)量見表2。對Bmal1基因在不同時間點的相對表達(dá)量數(shù)據(jù)用余弦分析系統(tǒng)進行余弦分析，發(fā)現(xiàn)Bmal1的表達(dá)呈規(guī)律性(P<0.05)，且振幅為0.28，表達(dá)趨勢見圖4。

表2 不同培養(yǎng)時間點Bmal1的相對表達(dá)量

注：以4 h的測量值作為基準(zhǔn) ， *表明基因表達(dá)呈規(guī)律性，P<0.05

圖4 Real Time-PCR檢測Bmal1在24 h內(nèi)不同時間點表達(dá)量

3 討論

Bmal1除了在哺乳類動物下丘腦視交叉上核(SCN)、松果體和視網(wǎng)膜中表達(dá)以外，在外周組織，如心臟、肝臟、腎臟、睪丸等組織中也有表達(dá)[11-12]。在小鼠妊娠第1-4天子宮、輸卵管以及未受精的卵母細(xì)胞中可檢測到Bmal1的表達(dá)，而受精后，Bmal1的表達(dá)水平降低，表明該基因在小鼠胚胎早期發(fā)育中起到一定的作用[13]。George 等[14]采用免疫組化對小鼠卵巢生物鐘蛋白進行表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠的卵巢中不僅存在生物鐘基因，在不同卵泡期中的表達(dá)量也存在差異，表明鐘蛋白在卵巢成熟中有著重要的作用。本研究通過免疫熒光對Bmal1在牦牛顆粒細(xì)胞中的表達(dá)定位，確定了牦牛顆粒細(xì)胞中存在Bmal1基因。為后期研究Bmal1基因在牦牛顆粒細(xì)胞的功能研究提供理論依據(jù)。

哺乳動物的許多生理過程和行為都是有節(jié)律的，這些節(jié)律是由位于哺乳動物SCN內(nèi)的內(nèi)源性分子鐘所調(diào)控的。SCN作為生物節(jié)律的起搏器，通過接收來自外界環(huán)境的刺激信號，以體液和神經(jīng)調(diào)節(jié)的形式使存在于全身周圍組織(如，卵巢等)中的無數(shù)輔助振蕩器同步，從而調(diào)節(jié)動物機體的生理及代謝過程[15-16]。哺乳動物生物鐘分子模型的核心是節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)路，反饋環(huán)路中激活因子和抑制因子的相互作用通過轉(zhuǎn)錄翻譯的正、負(fù)反饋調(diào)節(jié)，使節(jié)律基因呈現(xiàn)24 h的節(jié)律性變化，從而調(diào)節(jié)動物機體在24 h內(nèi)不同時間段的生理代謝[17]。研究認(rèn)為，卵泡膜細(xì)胞是調(diào)節(jié)動物排卵時間和幅度的重要振蕩器，當(dāng)有條件的對卵泡膜中的Bmal1基因的節(jié)律性表達(dá)進行干擾，雌性小鼠的排卵發(fā)生絮亂[18]。說明生物鐘基因在雌性動物生理周期性代謝中發(fā)揮著重要作用。Wusu Wang[10]等通過研究豬卵巢顆粒細(xì)胞生物鐘基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，經(jīng)地塞米松處理后，在體外培養(yǎng)不同時間點的豬顆粒細(xì)胞中，Bmal1和Per2都有著明顯的時鐘節(jié)律性表達(dá)。我們通過試驗證實了牦牛卵巢顆粒細(xì)胞中存在Bmal1基因，并假設(shè)該基因在牦牛顆粒細(xì)胞中呈一定的規(guī)律性表達(dá)。本研究利用qRT-PCR技術(shù)，檢測24 h內(nèi)不同體外培養(yǎng)時間點牦牛卵巢顆粒細(xì)胞中Bmal1基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Bmal1的表達(dá)呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，這與Chen[19]等的研究結(jié)果一致。這種規(guī)律性是動物機體在適應(yīng)外界環(huán)境如：晝夜交替、光照、氣溫變化等因素而形成的由生物鐘基因調(diào)控的機制[20-21]。試驗表明，牦牛顆粒細(xì)胞中存在著近日節(jié)律分子機制，根據(jù)結(jié)果可推測牦牛顆粒細(xì)胞中的Bmal1可能通過節(jié)律性地調(diào)控牦牛卵巢的生物代謝功能。Bmal1基因呈現(xiàn)的表達(dá)節(jié)律性是否對牦牛顆粒細(xì)胞激素分泌和顆粒細(xì)胞增殖、凋亡有所影響，還需要進一步研究。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，牦牛顆粒細(xì)胞中存在生物鐘基因；且Bmal1基因在體外24 h內(nèi)不同培養(yǎng)時間點的牦牛顆粒細(xì)胞中呈規(guī)律性表達(dá)，說明牦牛卵巢顆粒細(xì)胞中存在時鐘節(jié)律分子機制。試驗結(jié)果為進一步對牦牛顆粒細(xì)胞中的生物節(jié)律功能研究提供理論基礎(chǔ)。