袁廣富 ， 肖 娜 ， 張?jiān)鲑t ， 劉 瑩 ， 左玉柱 ， 范京惠

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河北 保定 071001 ; 2.河北省定州市動(dòng)物防疫監(jiān)督總站 ， 河北 定州 073000 ;3.河北省寧晉縣畜牧獸醫(yī)管理辦公室 , 河北 寧晉 055550)

牛巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一種敗血性傳染病，又稱(chēng)牛出血性敗血癥。牛巴氏桿菌最早發(fā)現(xiàn)于1881年，被認(rèn)為與多種野生動(dòng)物和家養(yǎng)動(dòng)物疾病相關(guān)[1]，牛巴氏桿菌分為5個(gè)莢膜型(A,B,D,E,F)和16個(gè)血清型(1～16)[2]。2010-2011年重慶市多個(gè)牛場(chǎng)發(fā)生牛巴氏桿菌感染致死病例[3]。2010-2012年在吉林省規(guī)模化牛養(yǎng)殖場(chǎng)的病牛中發(fā)現(xiàn)了牛巴氏桿菌的感染[4]。

本試驗(yàn)根據(jù)采集死亡牛的肝臟、腎臟、脾臟，經(jīng)過(guò)菌落形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性，進(jìn)行病原菌的分離純化及PCR鑒定，并對(duì)鑒定的病原菌進(jìn)行藥物敏感性分析，以確診該牛場(chǎng)牛群發(fā)病原因，挽救患牛生命，保障牛場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)不受損失，為減少疫病的發(fā)生提出防治措施。

1 材料與方法

1.1 病料 河北省衡水市某奶牛場(chǎng)無(wú)菌采集發(fā)病死亡奶牛的肝臟、腎臟、脾臟送至河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及儀器 血清瓊脂平板培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室配制；革蘭染色液，購(gòu)自濰坊市康華生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒、DL-2 000 DNA Marker(MD114)，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；光學(xué)顯微鏡，購(gòu)自尼康(Nikon)公司；2×TaqPCR Mix，購(gòu)自中科瑞泰生物科技有限公司；BIOWEST瓊脂糖，購(gòu)自上海玉博生物技術(shù)有限公司；Neofuge 13R高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司；PCR擴(kuò)增儀，購(gòu)自深圳市宇德立生物科技有限公司；DYY-8C電泳儀，購(gòu)自北京市六一儀器廠；Protein simple凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自普諾森生物科技(上海)有限公司；HWS智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，購(gòu)自寧波江南儀器廠。

1.3 臨床癥狀觀察及剖檢記錄 通過(guò)對(duì)牛場(chǎng)工作人員的詢(xún)問(wèn)記錄該牛場(chǎng)患牛的臨床癥狀；對(duì)患病死亡牛進(jìn)行剖檢，觀察患病牛組織病理變化并記錄。

1.4 病原菌的分離與培養(yǎng) 無(wú)菌采集死亡牛肝臟、腎臟、脾臟的病健交界處剪取一小塊組織樣本，同時(shí)無(wú)菌接種于血清瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取一單菌落涂于載玻片上，按照革蘭染色液的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行革蘭染色并鏡檢，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，對(duì)分離菌進(jìn)行初步鑒定。再挑取一單菌落，將單菌落接種至LB-血清液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖培養(yǎng)20 h，備用。

1.5 PCR鑒定

1.5.1 引物設(shè)計(jì)與合成 利用Primer 5.0 引物設(shè)計(jì)的軟件，根據(jù)GenBank上細(xì)菌的基因序列進(jìn)行同源性多重比對(duì)并獲得其保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)通用PCR引物，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成(見(jiàn)表1)。

表1 通用引物信息

1.5.3 瓊脂糖凝膠回收 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收純化目的片段，在UV透射儀下，將目的片段從膠上切下放入離心管中，加入1倍體積的Buffer GC,60 ℃水浴10 min至膠融化。根據(jù)寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司的膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行目的片段回收純化，最終獲得的膠回收產(chǎn)物。

1.5.4 PCR擴(kuò)增序列分析 將最終獲得的膠回收產(chǎn)物送至北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行同源性比較。

1.6 藥敏試驗(yàn) 在無(wú)菌操作臺(tái)中吸取已鑒定后培養(yǎng)的菌液50L，分別轉(zhuǎn)移至3個(gè)血清瓊脂培養(yǎng)基中并均勻涂開(kāi)，用鑷子夾取21種藥敏紙片，每個(gè)血清瓊脂培養(yǎng)基表面按壓7種藥敏紙片，并做好標(biāo)記，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺量取抑菌環(huán)直徑，參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)動(dòng)物源細(xì)菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分別以敏感、中介和耐藥3種形式對(duì)藥物敏感性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察及剖檢記錄 患病牛發(fā)病初期體溫升高，達(dá)到41.3～42.5 ℃，心跳加快，皮溫不整，精神不振，食欲減退或廢絕，氣喘流涎，鼻鏡干裂，被毛粗亂，病牛會(huì)出現(xiàn)腹痛，偶爾會(huì)出現(xiàn)空嚼癥狀，嚴(yán)重時(shí)病牛出現(xiàn)呼吸困難，呼吸頻率加快，全身衰弱，倒地俯臥。對(duì)患病牛進(jìn)行剖檢可見(jiàn)，皮下組織及肌肉均有出血點(diǎn)，脾臟有點(diǎn)狀出血，但不腫脹；肝臟和腎臟有實(shí)質(zhì)性變性；胸腔內(nèi)有大量纖維素性滲出物存在；淋巴結(jié)腫大、出血。

2.2 病原分離培養(yǎng) 病料接種至血清瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，經(jīng)過(guò)16 h后生長(zhǎng)為光滑、濕潤(rùn)的圓形菌落；病料接種至麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)細(xì)菌；病料接種至血液瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)像露珠一樣的小菌落，無(wú)溶血現(xiàn)象；病料接種至普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)貧瘠，生長(zhǎng)狀況較差。挑取生長(zhǎng)良好的單一菌落，經(jīng)過(guò)革蘭染色鏡檢為革蘭陰性短桿菌。

2.3 PCR鑒定結(jié)果 經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出現(xiàn)的目的條帶與預(yù)期目的條帶大小一致(見(jiàn)圖1)；將牛巴氏桿菌的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，將16S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，與牛巴氏桿菌基因序列的同源性達(dá)99%，進(jìn)一步確定送檢患病牛感染巴氏桿菌。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的JQ404475、JQ726501、JQ975927、JQ975948、JX975443、JX975446相應(yīng)的16S rDNA序列進(jìn)行比較，其同源性在98%～100%之間(見(jiàn)圖2、圖3)。

圖1 牛巴氏桿菌PCR擴(kuò)增
M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ; 1-3：牛巴氏桿菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 牛巴氏桿菌16S rDNA基因同源性

圖3 牛巴氏桿菌16S rDNA基因進(jìn)化樹(shù)

2.4 耐藥性分析結(jié)果 本研究選擇21種藥敏片參考CLSI動(dòng)物源細(xì)菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分別以敏感、中介和耐藥3種形式對(duì)已分離鑒定的病原菌進(jìn)行耐藥性分析，分析結(jié)果見(jiàn)表2，從患病牛分離的巴氏桿菌對(duì)林可霉素、慶大霉素等13種抗生素不同程度耐藥；對(duì)頭孢噻肟、頭孢唑林、米諾環(huán)素、恩諾沙星、氨芐西林、氟苯尼考敏感。見(jiàn)表2。

表2 牛巴氏桿菌耐藥性分析結(jié)果 (mm)

3 討論

牛巴氏桿菌病是由于感染巴氏桿菌而引起的傳染病，又稱(chēng)出血性敗血癥[5]，往往出現(xiàn)突然發(fā)病，有較高的死亡率。隨著養(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展，牛巴氏桿菌病對(duì)牛場(chǎng)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖戶(hù)的經(jīng)濟(jì)效益[6]。

該牛場(chǎng)患病牛出現(xiàn)體溫升高，精神不振，反芻次數(shù)減少，反應(yīng)遲鈍，呼吸困難，眼結(jié)膜潮紅等臨床癥狀，部分患病牛衰竭死亡，剖檢可見(jiàn)嚴(yán)重的肌肉及內(nèi)臟出血。初步認(rèn)定為牛巴氏桿菌感染，為對(duì)患病牛進(jìn)行確診，將無(wú)菌采集發(fā)病死亡牛的肝臟、腎臟、脾臟進(jìn)行一系列的檢測(cè)為陽(yáng)性，并將陽(yáng)性產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，與牛巴氏桿菌基因序列具有高度同源性，確診為牛巴氏桿菌病。

牛巴氏桿菌是一種短小、兩端鈍圓的球桿狀或短桿菌，多呈散在、無(wú)運(yùn)動(dòng)性，不形成芽孢，革蘭陰性，兩極濃染，又叫兩極桿菌至麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)細(xì)菌；至血液瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)像露珠一樣的小菌落，無(wú)溶血現(xiàn)象；至普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)貧瘠，生長(zhǎng)狀況較差；至血清瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，經(jīng)過(guò)16 h后生長(zhǎng)為光滑濕潤(rùn)的圓形菌落[7]，并且與很多細(xì)菌的形態(tài)相似，但在生化反應(yīng)上有所區(qū)別。

在本試驗(yàn)中，牛巴氏桿菌對(duì)頭孢噻肟、頭孢唑林、米諾環(huán)素、恩諾沙星、氨芐西林、氟苯尼考敏感；而對(duì)環(huán)丙沙星、林可霉素等13種抗生素耐藥。通常情況下，臨床上治療牛巴氏桿菌病的抗菌藥物有環(huán)丙沙星、洛美沙星、紅霉素和阿奇霉素等[8],由于抗生素的長(zhǎng)期不合理、不適量使用，導(dǎo)致牛巴氏桿菌對(duì)臨床多種抗生素都有不同程度的耐藥，并且菌株的耐藥性還在不斷增強(qiáng)[9]。2015年俸忠蘭等[7]對(duì)牛巴氏桿菌的耐藥性分析結(jié)果和2016年劉順磊等[10]對(duì)牛巴氏桿菌的耐藥性檢測(cè)都已經(jīng)反映出由于超量的不適當(dāng)使用，牛巴氏桿菌的耐藥程度越來(lái)越嚴(yán)重，并且嚴(yán)重影響了藥物的治療效果和養(yǎng)牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[11-14]。

預(yù)防本病的關(guān)鍵在于平時(shí)注意改善舍內(nèi)的通風(fēng)和飼養(yǎng)管理，避免通風(fēng)不良，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)牛群的健康狀況，按時(shí)進(jìn)行疫苗接種，本病對(duì)該牛場(chǎng)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，本試驗(yàn)為確診該牛場(chǎng)牛群發(fā)病原因并提出恰當(dāng)?shù)姆乐未胧?，建議選擇敏感藥物進(jìn)行用藥，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,保障養(yǎng)牛業(yè)的健康快速發(fā)展。