劉夢(mèng)瑤 ， 張秋楠 ， 吳文學(xué) ， 李金祥

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 , 北京 海淀 100193 ； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 ， 北京 海淀 100083)

急性的牛病毒性腹瀉和慢性的黏膜病均為牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhoea virus，BVDV)引起的包括厭食、胃腸糜爛、腹瀉等消化道癥狀，鼻腔和眼睛排出漿液性分泌液等呼吸道癥狀和流產(chǎn)、死胎、畸形胎等生殖系統(tǒng)癥狀的疾病。牛傳染性鼻氣管炎為牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起牛的以膿性鼻分泌物、黏膜充血、結(jié)膜炎等上呼吸道的臨床癥狀為主的疾病。這2種傳染病均在全球普遍存在，已成為各養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)國家牛場(chǎng)中的主要傳染病。BVDV以直接或間接接觸方式通過消化道、呼吸道和胎盤傳播，IBRV也以接觸方式通過眼睛、呼吸道和生殖道傳播[1]。在我國牛場(chǎng)，這2種病毒的感染率很高，在鼻拭子、生殖道拭子等組織樣中均可能同時(shí)存在，因而建立一種能夠同時(shí)檢測(cè)這2種病原的qPCR方法，對(duì)于臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和菌株 牛支原體PD株及PG45株、牛冠狀病毒(BCV)BJ株、牛腺病毒3型(BAV3)SF-4株、牛輪狀病毒(BRV)BJ株、牛副流感病毒 3型(BPIV3)WBR-1株、牛病毒性腹瀉病毒SZH株、牛傳染性鼻氣管炎病毒SZH株等臨床分離株由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。牛支原體PG45株購自美國模式菌種收集中心，腸炎沙門菌CVCC3949株、多殺性巴氏桿菌CVCC391株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 主要試劑 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Pre-mixExTaqTM(Probe qPCR)購自寶生物工程(大連)有限公司；氨芐青霉素、pEASY-T1 克隆質(zhì)粒、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)、EasyTaqPCR Mix、TransTaqHiFi PCR Mix I、TransScript cDNA合成Mix等，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等，均購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 Biometra GmbH Power Cycler SL 96 Gradient常規(guī)PCR儀、Light Cycler?96 Real-time PCR儀、ThermoFisher NanoDrop 2000c 全自動(dòng)核酸微量測(cè)定儀。

1.1.4 引物與探針 BVDV的qPCR引物和探針參考文獻(xiàn)報(bào)道序列(BVDVF：5′-TAGCCATGCCCTTAGTAGGACT-3′，BVDVR：5′-GAACCACTGACGACTACCCTGT-3′，BVDV Probe：HEX-CAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCT-BHQ2)[2]，IBRV qPCR引物和探針參考文獻(xiàn)報(bào)道序列(IBRVF：5′-GGGCATCGCCTCGTTTATT-3′，IBRVR：5′-CGTGGTGATCGGGTACAGC-3′，IBRV Probe：FAM-CCCGCCTCCGCAGCAA-MGB)[3]。BVDV PCR引物參考文獻(xiàn)報(bào)道序列(BVDVF2：5′-ATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3′，BVDVR2：5′-TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3′)[4]。IBRV PCR引物參考文獻(xiàn)報(bào)道序列(IBRVF2：5′-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3′，IBRVR2：5′-GCGTCAAAC-TCCTCCTCTTCCTC-3′)[5]。

1.2 方法

1.2.1 陽性質(zhì)粒的制備 分別獲取BVDV的DNA和IBRV的RNA并將BVDV的RNA反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增相應(yīng)目的序列。PCR反應(yīng)體系：BVDVF和BVDVR 0.5 μL或IBRVF和IBRVR 0.5 μL，BVDV的cDNA或IBRV的DNA 2 μL，Mix 12.5 μL、 ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35次；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物進(jìn)行電泳并回收目標(biāo)條帶，與克隆質(zhì)粒pEASY-T1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3) ，接種有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基，取單菌落接種于有氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜，菌液離心，取沉淀提取質(zhì)粒，通過PCR和測(cè)序鑒定。對(duì)BVDV和IBRV陽性質(zhì)粒進(jìn)行核酸濃度測(cè)量并計(jì)算拷貝數(shù)。

1.2.2 雙重qPCR的優(yōu)化 分別設(shè)定50.0 ℃，50.2 ℃，50.9 ℃，52.0 ℃，53.2 ℃，54.4 ℃，55.6 ℃，56.8 ℃，58.0 ℃，59.1 ℃，59.8 ℃，60.0 ℃ 12個(gè)退火溫度，采用1.2.1項(xiàng)方法對(duì)BVDV或IBRV陽性質(zhì)粒進(jìn)行PCR，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果確定最適退火溫度。分別用0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L或0.5 μmol/L 5種濃度的引物和探針配置20 μL反應(yīng)體系(含Pre-Mix 10 μL、BVDV和 IBRV模板 2.0 μL)，進(jìn)行qPCR(95 ℃預(yù)熱30 s，三步法95 ℃變性 5 s ，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán)45次)，根據(jù)Ct值和曲線峰值確定最優(yōu)引物濃度和探針濃度。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 參照海日汗的方法[6]構(gòu)建陽性質(zhì)?？截悢?shù)-Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 特異性分析 利用優(yōu)化的雙重qPCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件對(duì)多殺性巴氏桿菌、腸炎沙門菌、牛支原體PD株及PG45株、BCV、BRV和BPIV3全基因組cDNA、BAV3和IBRV全基因組DNA、BVDV全基因組RNA和cDNA進(jìn)行檢測(cè)，以107拷貝/μL的BVDV和IBRV的陽性質(zhì)粒DNA作為陽性模板， ddH2O作為陰性對(duì)照。

1.2.5 敏感性分析 分別以101、102、103、104、105、106拷貝/μL 的BVDV陽性質(zhì)粒DNA和10-2、10-1、100、101、102、103拷貝/μL的IBRV陽性質(zhì)粒為模板，進(jìn)行雙重qPCR，同時(shí)采用1.2.1中方法對(duì)不同濃度的 BVDV和IBRV陽性質(zhì)粒溶液進(jìn)行PCR檢測(cè)，確定2種方法的最低檢測(cè)限。

1.2.6 重復(fù)性分析 采用雙重qPCR方法對(duì)107拷貝/μL的BVDV和IBRV陽性質(zhì)粒溶液進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)重復(fù)。采用相同方法對(duì)84.5 ng/μL的BVDV和95.3 ng/μL的IBRV核酸進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 從北京和上海4家牛場(chǎng)采集140份鼻拭子、血清和全血樣本。提取核酸，用TransScript First-Strand cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行雙重qPCR和PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 陽性質(zhì)粒的制備 BVDV和IBRV克隆質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳，分別獲得了102 bp和148 bp目的條帶(圖1)，經(jīng)測(cè)序與目的基因序列相符。質(zhì)粒濃度分別為2.25×1010拷貝/μL和1.47×1010拷貝/μL。

2.2 雙重qPCR的優(yōu)化 根據(jù)雙重qPCR優(yōu)化結(jié)果(見中插彩版圖2)，最適退火溫度為54.0 ℃，BVDV引物濃度和探針濃度分別為0.2 μmol/L和0.2 μmol/L，IBRV引物濃度和探針濃度分別為0.3 μmol/L 和0.1μmol/L。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 BVDV和IBRV標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，其斜率分別為-3.119 2、-3.015 9，相關(guān)系數(shù)分別為0.99、1.00，擴(kuò)增效率分別為109%、115%，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性關(guān)系。

2.4 特異性分析 雙重qPCR結(jié)果顯示，BVDV和IBRV的陽性質(zhì)粒、IBRV全基因組DNA和BVDV的全基因組cDNA均有熒光擴(kuò)增曲線，多殺性巴氏桿菌、腸炎沙門菌、牛支原體PD株及PG45株、BVDV的全基因組RNA ，BCV、BRV和BPIV3全基因組cDNA、BAV3全基因組DNA 及ddH2O均無熒光擴(kuò)增曲線，說明建立的雙重qPCR方法有較強(qiáng)的特異性。

圖1 BVDV和IBRV陽性質(zhì)粒的PCR檢測(cè)結(jié)果
M： 低分子量Marker ; 1：BVDV ; 2：IBRV

圖2 BVDV和IBRV雙重qPCR熒光擴(kuò)增曲線圖
A： BVDV不同引物濃度熒光擴(kuò)增曲線圖 ; B： IBRV不同引物濃度熒光擴(kuò)增曲線圖 ; C： BVDV不同探針濃度熒光擴(kuò)增曲線圖 ;D： IBRV BVDV不同探針濃度熒光擴(kuò)增曲線圖

圖3 BVDV和IBRV標(biāo)準(zhǔn)曲線A： BVDV標(biāo)準(zhǔn)曲線; B： IBRV標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 敏感性分析 雙重qPCR結(jié)果顯示，最低檢測(cè)限為BVDV 102拷貝/μL、IBRV 100拷貝/μL，PCR的最低檢測(cè)限為BVDV 103拷貝/μL、IBRV 102拷貝/μL。

2.6 重復(fù)性分析 雙重qPCR檢測(cè)結(jié)果(見表1)表明，BVDV和IBRV陽性質(zhì)粒的變異系數(shù)分別為1.04%、1.31%，BVDV和IBRV核酸的變異系數(shù)分別為1.80%和1.98%。說明該qPCR方法的重復(fù)性良好。

2.7 臨床樣品檢測(cè) 雙重qPCR檢測(cè)結(jié)果(見表2)顯示，140份臨床樣品中BVDV陽性率15.71%、IBRV陽性率12.14%、BVDV+IBRV陽性率5.00%。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，140份臨床樣品的BVDV和IBRV均為陰性。

表1 雙重qPCR重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

表2 臨床樣品的BVDV和IBRV陽性率

3 討論

牛病毒性腹瀉及黏膜病普遍流行于養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)的國家，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。Deng等對(duì)2010-2013年間采自我國8省1 379頭臨床健康奶牛、肉牛、牦牛和水牛的血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)，BVDV抗體陽性率58.09% (801/1 379)、病原分離陽性率1.39% (14/1 010)、核酸陽性率22.64%(146/645)，其中奶牛的陽性率分別為89.49% (298/333)、0.00% (0/116)和32.06% (42/131)，基因型為BVDV-1，其中BVDV-1b占33.06%、BVDV-1m占49.19%、BVDV-1u占17.74%[7]。2014年，上海市2個(gè)未接種疫苗的規(guī)模化奶牛場(chǎng)的BVDV抗體陽性率高達(dá)97.4%和96.7%，但病原分離陽性率很低，僅為1.3%[8]。2009-2010年間，愛爾蘭305個(gè)未免疫奶牛群犢牛的BVDV抗體陽性率為88%(268/305)，其中290日齡左右奶牛的BVDV抗體陽性率為25%[9]。

牛傳染性鼻氣管炎雖然病死率低，但對(duì)牛的生長和產(chǎn)奶量影響很大，這也影響了活牛、奶和乳制品的國際貿(mào)易，是養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要原因。牛傳染性鼻氣管炎是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)B類疾病及我國二類動(dòng)物疫病，也是預(yù)防動(dòng)物疾病及保證國際貿(mào)易安全的關(guān)鍵。據(jù)調(diào)查，2011年我國北方6省市14個(gè)未免疫的規(guī)模化奶牛場(chǎng)3-5歲泌乳奶牛IBRV抗體陽性率分別為：山東46%(27/59)、河北28%(17/60)、河南86%(43/50)、內(nèi)蒙古58%(21/36)、新疆68%(82/120)、北京40%(20/50)[10]；2014年，上海市2個(gè)未接種疫苗的規(guī)?；膛?chǎng)的IBRV抗體陽性率各為41.2%和74.3%[8]；2009-2010年間，愛爾蘭305個(gè)未免疫奶牛群的犢牛BoHV-1抗體陽性率為80%(244/305)，其中290日齡左右奶牛的BoHV-1抗體陽性率為5.4%[9]；2011年巴西圣保羅州3個(gè)奶牛場(chǎng)BoHV-1 抗體陽性率分別為78.6%、40.0%和1.6%[11]。

抗體中和試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、動(dòng)物接種試驗(yàn)、組織學(xué)診斷、細(xì)胞培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法皆可用于診斷感染BVDV和IBRV的急性期和潛伏期，但都有靈敏度低、耗時(shí)或假陽性等缺點(diǎn)。而PCR方法迅速、操作簡便且敏感性、特異性好，能夠很好地彌補(bǔ)以上方法的缺點(diǎn)。在我國，牛群經(jīng)常存在2種病原混合感染(尤其是潛伏感染)，而且這2種病原也都會(huì)存在于血液、呼吸道和生殖道等部位，因此建立同時(shí)檢測(cè)這2種病原的方法，無疑會(huì)提高檢測(cè)臨床樣品的效率。本文利用文獻(xiàn)報(bào)道的引物及探針序列將BVDV和IBRV特異性探針分別標(biāo)記上HEX熒光基團(tuán)和FAM熒光基團(tuán)，通過優(yōu)化引物、探針濃度和反應(yīng)條件，建立了BVDV和IBRV雙重qPCR檢測(cè)方法。BVDV和IBRV的檢測(cè)限分別達(dá)到了102拷貝/μL和100拷貝/μL，BVDV靈敏度與OIE推薦的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法相近[12]，IBRV靈敏度高于OIE推薦的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法[13]、Peili等建立的等溫重組酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法[14]和Marina等建立的高分辨率熔煉實(shí)時(shí)熒光PCR方法[15]。利用本方法檢測(cè)多殺性巴氏桿菌、腸道沙門菌、牛支原體、牛冠狀病毒、牛腺病毒3型、牛輪狀病毒、牛副流感病毒3型均為陰性，證明該qPCR方法特異性良好。鑒于qPCR方法只能擴(kuò)增DNA，對(duì)血液、血清和鼻拭子樣品的RNA和DNA共提取后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，結(jié)果顯示，這種前處理對(duì)于雙重qPCR方法對(duì)BVDV和IBRV的檢測(cè)均無明顯干擾。綜上所述，本文建立了同時(shí)定量、快速、靈敏地檢測(cè)出血清、全血和鼻拭子中BVDV和IBRV的雙重qPCR方法，在牛場(chǎng)BVDV和IBRV監(jiān)測(cè)和凈化工作中具有重要應(yīng)用價(jià)值。