李東霖，董莎莎，李東東，李文昊，閆喜武，聶鴻濤

(大連海洋大學水產與生命學院，遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心，遼寧 大連 116023)

加州扁鳥蛤(Clinocardiumcaliforniense)又稱為鳥蛤，俗稱鳥貝，隸屬于軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、簾蛤目(Veneroida)、鳥蛤科(Cardiidae)、扁鳥蛤屬(Clinocardium)，為冷水種類，在美國西岸的加利福尼亞經白令海、霍爾木茲海、日本海及日本的北海道與本州北部及朝鮮海峽到黃渤海均有分布[1]。加州扁鳥蛤因肉質鮮美，已成為了一種備受關注的經濟貝類。目前對其生理習性方面的探究較少，大部分研究均集中在苗種培育及增養(yǎng)殖技術、繁殖周期和繁殖生理等領域[2-8]。

堿性磷酸酶(AKP)是動物代謝過程中重要的調控酶，是一種非特異性的磷酸水解酶,能催化磷酸單脂水解及磷酸基團的轉移反應,對動物的生存具有重要的意義[9-10]。AKP對水中鈣質的吸收、磷酸鈣的形成、甲殼素的分泌及形成均具有重要作用，是水產動物賴以生長、生存的重要酶類之一[9]。琥珀酸脫氫酶(SDH)參與三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化作用，SDH活力可在一定程度上反映有氧代謝水平。溫度是影響水產動物呼吸代謝酶活力最重要的因素之一[11-13]，底質條件是影響水產動物存活和生長的另一重要生態(tài)因子，可影響其生存、發(fā)育、生長和繁殖等行為[14-19]。因此，開展底質條件對加州扁鳥蛤的潛沙行為及呼吸代謝酶活性的影響研究十分必要。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用加州扁鳥蛤采自遼寧省大連灣海域，于2016年10月25日運回實驗基地。從中精選出貝殼完整、健康有活力的個體，先在塑料水槽(50 cm×30 cm×35 cm)中暫養(yǎng)一周。海水鹽度為30，空調控制室溫為17 ℃，水循環(huán)系統(tǒng)控制水溫范圍為(15.0±0.5)℃，pH值范圍為8.0～8.1，溶解氧范圍為6.5～7.0 mg/L，每天換水一次，每天喂一次餌料(用200目篩絹網，搓洗螺旋藻粉，形成濃綠色溶液，每個水槽一次投喂50 mL 0.1 g螺旋藻粉，餌料密度 1.0×104cells/mL)。

1.2 實驗方法

設定含沙量梯度為0、25%、50%、75%和100% 5個梯度，底質厚度設定為6 cm(實驗所選的加州扁鳥蛤殼長大都大于5 cm，底質厚度為6 cm時能滿足加州扁鳥蛤的潛沙活動)，每個梯度3個平行實驗，在每個水槽中放5只加州扁鳥蛤，加州扁鳥蛤生物學數(shù)據，見表1。每12 h觀察并記錄實驗組加州扁鳥蛤的潛沙行為。養(yǎng)殖1個月后，各組加州扁鳥蛤生長、攝食狀態(tài)良好，不再有死亡現(xiàn)象。隨機選取每個水槽中的2個個體，采集組織樣本，制作組織勻漿，測定AKP、SDH和LDH 3種酶的活性，取樣前24 h停止投喂餌料。實驗結束時，統(tǒng)計每個含沙量下加州扁鳥蛤的存活率。

設定底質厚度為0、1.5、3.0、4.5和6.0 cm 5個梯度，底質含沙量為75%，每個梯度做3個平行試驗組，在每個水槽中放5只加州扁鳥蛤，加州扁鳥蛤生物學數(shù)據，見表2，其他實驗條件同1.1實驗材料所述。各實驗組的加州扁鳥蛤養(yǎng)殖1個月后，隨機選取每個水槽中的2個個體，采集組織樣本，制作組織勻漿，測定各種酶的活性，取樣前24 h停止投喂餌料。實驗結束時，統(tǒng)計不同底質厚度實驗組的死亡率。

表1 不同含沙量下加州扁鳥蛤的生物學數(shù)據Tab.1 Biological characteristics ofC.californiensein different sand/mud ratio n=3

表2 不同底質厚度下加州扁鳥蛤的生物學數(shù)據Tab.2 Biological characteristics ofC.californiensein different substrates thickness n=3

1.3 樣品制備和酶活力測定

取樣時在冰上用無菌鑷子、解剖刀等工具將雙殼剖開，取出其內臟組織團，電子天平(賽多利斯，上海)稱重(每個個體取0.3 g組織)，在冰水浴的條件下用玻璃勻漿器勻漿后，離心機離心15 min(4 ℃、3 500 r/min)，取上清液進行酶活力檢測。蛋白含量及相關呼吸代謝酶活力的測定均按照南京建成生物公司的檢測試劑盒說明書進行。

1.4 數(shù)據分析

原始數(shù)據經Excel 2010初步整理，采用SPSS 19.0中的單因素方差分析(one-way ANOVA)，對數(shù)據進行統(tǒng)計分析，并進行Fisher’s LSD 多重比較。統(tǒng)計結果用(平均值±標準誤)表示，數(shù)據表示方式(MEAN±SEM),差異顯著性水平以P<0.05為判定標準。

2 結果

2.1 含沙量和底質厚度對加州扁鳥蛤的潛沙率和存活率的影響

隨著底質含沙量的升高，每12 h觀察并記錄實驗組加州扁鳥蛤的潛沙行為，發(fā)現(xiàn)加州扁鳥蛤的潛沙率不斷升高，含沙量為50%～75%時，潛沙率最高達到100%，潛沙深度最大為5.6 cm(表3)。在0～25%含沙量范圍，潛沙率很低；在底質含沙量75%時，存活率最高達93.3%，說明此環(huán)境適合加州扁鳥蛤生存。含沙量對加州扁鳥蛤的潛沙率和存活率均有顯著性影響(P<0.05)；含沙量在50%和75%時潛沙率顯著高于其他3組(P<0.05)；各組含沙量之間的存活率，均存在顯著性差異(P<0.05)。

表3 含沙量對潛沙行為的影響Tab.3 Effect of sand/mud ratio on burrowing behavior

注:同列不同字母代表差異顯著(P<0.05)，下同。

隨著底質厚度的增加，潛沙率明顯上升，并在底質厚度為4.5和6.0 cm時達到最高100%，潛沙最深為5.8 cm左右。底質厚度在4.5 cm時存活率最高(表4)。底質厚度對加州扁鳥蛤的潛沙率和存活率均有顯著影響(P<0.05)；厚度在4.5和6.0 cm時的潛沙率顯著高于其他3組(P<0.05)；0、1.5和3.0 cm時的存活率顯著低于其他兩組(P<0.05)，且三者之間無顯著性差異(P>0.05)。

表4 底質厚度對潛沙行為的影響Tab.4 Effect of different substrates thickness on burrowing behavior

2.2 含沙量和底質厚度對加州扁鳥蛤堿性磷酸酶活力的影響

隨著含沙量的升高，AKP酶活性總體趨勢為：先緩慢上升后有所下降。在含沙量為75%時，酶活性達到峰值；含沙量為時0，即底質全泥時，AKP酶活性最低(圖1)。根據單因素方差分析比較，含沙量為75%時，酶活性與其他4種含沙量實驗組差異顯著(P<0.05)，其他4組之間無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 含沙量對堿性磷酸酶酶活性的影響(n=3)不同字母(a-e)之間差異顯著(P<0.05)。下同。Fig.1 Effect of sand percentage on AKP activity(n=3)Different lowercase letter a, b, c and d indicate significant different between group (P<0.05).The same below.

隨著底質厚度的增加，AKP酶活性總體趨勢為：先緩慢升高，后稍微降低并趨于穩(wěn)定。在底質厚度為3.0 cm時，AKP酶活性達到峰值；在底質厚度為0 cm時，酶活性最低(圖2)。底質厚度為3.0 cm時，酶活性顯著高于其他4組(P<0.05)；底質厚度為0 cm時酶活性顯著低于4.5和6.0 cm組(P<0.05)。1.5、4.5和6.0 cm實驗組之間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 底質厚度對堿性磷酸酶酶活性的影響Fig.2 Effect of different sediment depth on AKP activity

2.3 含沙量和底質厚度對加州扁鳥蛤琥珀酸脫氫酶活力的影響

隨著含沙量的升高，SDH酶活性總體趨勢為：先不斷升高后趨于平穩(wěn)，在含沙量為75%～100%時，酶活性達到峰值；在含沙量為0～25%時，即底質含泥多時，SDH酶活性較低(圖3)。含沙量對加州扁鳥蛤的SDH酶活性有顯著影響(P<0.05)；含沙量為75%和100%時的酶活性顯著高于其他3種條件(P<0.05)；0、25%、50% 3種之間也有顯著差異(P<0.05)。

圖3 含沙量對琥珀酸脫氫酶活性的影響Fig.3 Effect of sand percentage on SDH activity

隨著底質厚度的增加，SDH酶活性總體趨勢為：先升高再趨于平穩(wěn)，后稍有降低。在底質厚度為3.0和4.5 cm時，SDH酶活性高；在底質厚度為0 cm時，酶活性最低(圖4)。底質厚度為0、6 cm時的酶活性顯著低于其他3組(P<0.05)且兩者之間無顯著差異(P>0.05)；其他3組之間的酶活性無顯著差異(P>0.05)。

2.4 含沙量和底質厚度對加州扁鳥蛤乳酸脫氫酶活力的影響

隨著含沙量的升高，LDH酶活性總體趨勢表現(xiàn)為：先緩慢降低后趨于平穩(wěn)，在含沙量為0時，LDH酶活性最高；在含沙量為50%～100%時，酶活性低且數(shù)值波動小，相對穩(wěn)定(圖5)。含沙量對LDH酶活性有顯著影響(P<0.05)；含沙量為0和25%時酶活性與其他3組差異顯著(P<0.05)；50%、75%和100%的3組之間無顯著差異(P>0.05)。

隨著底質厚度的增加，LDH酶活性總體趨勢表現(xiàn)為：先上升后趨于平穩(wěn)。在底質厚度為3.0～6.0 cm時，LDH酶活性達到最高，且數(shù)值上下波動很?。辉诘踪|厚度為0 cm時，酶活性最低(圖6)。底質厚度為0、1.5 cm的酶活性顯著低于其他3組(P<0.05)，且兩者之間無顯著差異(P>0.05)；其他3組底質厚度3.0、4.5和6.0 cm之間無顯著差異(P>0.05)。

圖4 底質厚度對琥珀酸脫氫酶活性的影響Fig.4 Effect of different substrate thickness on SDH activity

圖5 含沙量對乳酸脫氫酶活性的影響Fig.5 Effect of sand/mud ratio on LDH activity

圖6 底質厚度對乳酸脫氫酶活性的影響Fig.6 The effect of different substrate thickness on LDH activity

3 討論

3.1 不同底質對加州扁鳥蛤潛沙及存活的影響

加州扁鳥蛤有潛沙的習性，在潛進底質后通過露出的進出水管感知外界水流。實驗中每隔12 h觀察并記錄加州扁鳥蛤的潛沙行為。含沙量對加州扁鳥蛤的潛沙率和存活率均有顯著影響；含沙量為50%和75%時，潛沙率顯著高于其他3組；各組之間的存活率均存在顯著差異(P<0.05)。含沙量為50%～75%，潛沙率100%時，潛沙深度最深為5.6 cm。在含沙量為0和25%時，潛沙率較低，說明底質含泥量高影響潛沙行為。向含沙量25%實驗組投喂螺旋藻液后，每隔5 h觀察發(fā)現(xiàn)其攝食較其他幾組慢，潛沙行為不活躍，存活率很低，僅為53.3%。含沙量為75%時，存活率最高達93.3%，實驗組僅有一只死亡，說明此環(huán)境很適宜加州扁鳥蛤生存，潛沙行為和生理代謝水平均較高。

底質厚度對加州扁鳥蛤的潛沙率和存活率影響顯著：厚度為4.5和6.0 cm時，潛沙率顯著高于其他3組(P<0.05)；0、1.5和3.0 cm的存活率顯著低于其他兩組，且三者之間無顯著差異(P>0.05)。可以看出底質厚度在3.0 cm以下時，加州扁鳥蛤基本無潛沙行為，個體不活躍；在4.5、6.0 cm時，潛沙率可達最高100%，潛沙最深為5.8 cm左右。投喂螺旋藻液后，每隔5 h看水色變淡的速度，厚度在4.5和6.0 cm時攝食情況較其他幾組要好。而且底質厚度在4.5 cm時，存活率最高為93.3%，推斷該條件是加州扁鳥蛤適宜的底質環(huán)境。

3.2 含沙量對加州扁鳥蛤呼吸代謝酶活力的影響

堿性磷酸酶(AKP)催化磷酸單脂的水解及磷酸基團的轉移反應，對水中鈣質的吸收、磷酸鈣的形成、甲殼素的分泌及形成均具有重要作用，是水產動物賴以生存、生長的重要酶類之一[20-21]。加州扁鳥蛤是埋棲型貝類，一般都埋棲在底質中，通過露出的進出水管進行新陳代謝，由此可見底質對其的重要性。不同底質對其存活率和生長都有影響，AKP酶活性整體隨底質厚度的增加先升高后降低，由LSD多重比較可知：75%含沙量的酶活性顯著高于其他4組(P<0.05)；底質厚度為0 cm時，酶活性顯著低于4.5和6.0 cm時的AKP酶活性。在含沙量為0時，即底質全泥時AKP酶活性最低，代謝活動緩慢，能量代謝的磷酸化反應程度低；在0～50%范圍酶活性升高不明顯，可能是因為底質含泥量大，加州扁鳥蛤潛沙后活動量小，且機體代謝程度低，對外界物質的吸收利用率較低；而在含沙量為75%時，酶活性達到峰值，說明其對外界物質的吸收利用率也最高，以滿足機體代謝的需求，觀察發(fā)現(xiàn)投喂藻液后水色變淡的速度較快，表明其攝食速度比較快且生理狀態(tài)最活躍。

SDH酶活性隨含沙量的增加而不斷升高后趨于平穩(wěn)，由LSD多重比較可知：75%和100%含沙量時的酶活性顯著高于其他3種條件(P<0.05)；0、25%和50% 3組之間存在有顯著性差異。含沙量為0～25%底質含泥多，加州扁鳥蛤潛沙行為不活躍，生理活動不旺盛，氧化磷酸化反應程度低，故SDH酶活性較低；含沙量為50%～75%時，SDH酶活上升趨勢明顯，說明此階段有氧代謝比較旺盛；含沙量超過75%時，酶活性達到峰值并趨于穩(wěn)定，線粒體的呼吸作用加強，機體代謝旺盛，觀察投喂螺旋藻液后水色變淡的速度較快，可知攝食情況良好，生理狀態(tài)活躍。

LDH酶活性先是緩慢降低后趨于平穩(wěn)，經LSD多重比較可知：含沙量為0和25%時酶活性與其他3組存在顯著差異(P<0.05)；其余50%、75%和100% 3組之間無顯著性差異。含沙量為0時，機體氧化磷酸化反應程度很低，而其無氧代謝變得旺盛以彌補ATP的不足，LDH酶活力最高；在含沙量為50%或100%時，酶活性低且數(shù)值波動很小。從整個過程觀察到投喂螺旋藻液后，水色變淡的速度較慢，可知攝食速度較慢，潛沙行為不活躍，機體代謝水平保持在較低水平，加州扁鳥蛤生理活動較緩慢。在缺氧或者動物機體本身代謝過于旺盛但氧氣供應不足的環(huán)境條件下，機體能量主要通過糖酵解作用供應，AKP對糖酵解有重要作用，研究已經發(fā)現(xiàn)其和能量代謝有關，SDH參與氧化磷酸化作用和三羧酸循環(huán)循環(huán)，SDH的活力可在一定程度上反應有氧代謝的水平[22]。乳酸脫氫酶與細胞代謝活動關系密切，是糖酵解與TCA循環(huán)之間的關鍵酶[23]，其活力可作為衡量無氧代謝水平的指標之一。

3.3 底質厚度對加州扁鳥蛤呼吸代謝酶活力的影響

AKP酶活性隨底質厚度的增加而先升高后有所降低，根據LSD多重比較，底質厚度為3.0 cm時酶活性顯著高于其他4組(P<0.05)，底質厚度為0 cm時，酶活性顯著低于4.5和6.0 cm(P<0.05)。每隔12 h觀察其潛沙率，底質厚度小于3.0 cm時，實驗組加州扁鳥蛤基本不潛沙或達不到半數(shù)潛沙，在水中也基本不活動，機體代謝水平低。底質3.0 cm時，AKP酶活性最高，觀察加州扁鳥蛤活動狀況可知其喜好潛沙，生理狀態(tài)最好；每隔5 h觀察其攝食情況，發(fā)現(xiàn)底質在3.0和4.5 cm時，投喂螺旋藻液后水色變淡的速度較其他實驗組快，表明此時加州扁鳥蛤攝食速度快，可能是由于底質厚度在適宜其潛沙的范圍時，其攝食情況會相應變好。

SDH酶活性整體隨底質厚度的增加先升高后趨于降低；經LSD多重比較可知：底質厚度為0和6.0 cm時，SDH的酶活性顯著低于其他3組(P<0.05), 且兩者之間無顯著差異(P>0.05)；每隔12 h觀察加州扁鳥蛤的潛沙率，底質厚度小于3.0 cm時，基本達不到半數(shù)潛沙，機體有氧代謝水平低。底質為3.0～4.5 cm時，SDH酶活性最高，有氧代謝最旺盛，攝食和生理狀態(tài)較好。厚度達到6.0 cm時，潛底后有氧代謝速率稍有所降低，SDH酶活性有所下降。

LDH酶活性隨底質厚度的增加，整體呈現(xiàn)先升高后趨于平穩(wěn)趨勢；經LSD多重比較可知：底質厚度為0和 1.5 cm時的酶活性顯著低于其他3組，且兩者之間無顯著差異；其他3組(底質厚度為3.0、4.5、6.0 cm)之間無顯著差異。在底質厚度為3.0～6.0 cm時，LDH酶活性達到最高，加州扁鳥蛤潛沙后，機體代謝活動主要依賴無氧呼吸產生的能量；在底質厚度為0和1.5 cm時，基本無潛沙行為，機體主要進行有氧代謝，LDH酶活性在此時較低。投喂螺旋藻液后，每隔5 h看水色變淡的速度，在底質厚度為0 cm時攝食速度最慢，其他實驗組正常，可能底質厚度對其攝食和生理代謝有促進作用，使得加州扁鳥蛤潛沙后代謝水平相比沒有底質時高。

4 結論

本實驗中含沙量為75%時加州扁鳥蛤存活率最高，潛沙行為和生理代謝水平均較高。本實驗中隨著底質厚度的增加，AKP、LDH兩種酶活性升高，底質厚度為3 cm時，AKP酶活性最高，在底質厚度為4.5 cm時，LDH酶活性最高，說明底質增加，加州扁鳥蛤潛底后，無氧代謝糖酵解反應旺盛；SDH在厚度3.0 cm時酶活性最高，說明加州扁鳥蛤不完全潛底時，有氧代謝比較旺盛，機體比較活躍。因此，在加州扁鳥蛤養(yǎng)殖過程中，保證在適宜的底質條件進行人工養(yǎng)殖是提高成活率的關鍵因素之一。本研究結果可為今后開展加州扁鳥蛤的人工養(yǎng)殖提供參考。