鄭海紅 孫竹筠 叢雁方 張可煜 高飛 童光志

摘要：為獲得一種經(jīng)全長cDNA突變體拯救出的、隨著傳代次數(shù)的增多而最終致死的突變病毒，以嵌合感染性克隆p7AX12為骨架，分別在豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）M蛋白與N蛋白間或（和）N蛋白/3'UTR之間插入32 nt，依次構(gòu)建4個(gè)嵌合突變體pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R，經(jīng)DNA轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后4個(gè)嵌合突變體均能拯救出病毒，且拯救病毒中的突變或插入的堿基具有遺傳穩(wěn)定性。突變病毒傳代5次，沒有最終致死的原因還有待于進(jìn)一步研究分析。獲得的4個(gè)突變病毒也為研制PRRSV基因標(biāo)識疫苗及PRRSV復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）；M蛋白/N蛋白；N蛋白/3'UTR；反向遺傳操作

中圖分類號：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2019）03-0010-04

豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），是套式病毒目（Nidovirales）動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）成員之一[1]。該病毒引起的豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）給中國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)都帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。一直以來，免疫接種是控制豬繁殖與呼吸障礙綜合征的惟一有效措施，但由于目前現(xiàn)有的PRRSV傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗各自存在不同程度弱點(diǎn)，因此，高效安全的新型疫苗研發(fā)迫在眉睫[2]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對PRRSV認(rèn)識的不斷深入，尤其是反向遺傳操作技術(shù)[3，4]的發(fā)展，給豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒新型疫苗的研制帶來了極大希望。

p7AX12（未發(fā)表質(zhì)粒）是以弱毒株pAPRRS[4]為母體，嵌合了強(qiáng)毒株JX143[5]的N蛋白，并且在基因組M蛋白/N蛋白間引入了外源序列（包括酶切位點(diǎn)、M蛋白與N蛋白重疊4個(gè)氨基酸），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由p7AX12拯救的嵌合病毒v7AX12，在系列傳代過程中，基因組M蛋白/N蛋白間引入的外源序列不具有遺傳穩(wěn)定性，出現(xiàn)外源序列逐漸被刪除現(xiàn)象。推測刪除機(jī)制可能是引入的M蛋白與N蛋白重疊序列與PRRSV原本存在的這段序列存在序列重復(fù)從而導(dǎo)致了外源序列的刪除，此現(xiàn)象類似于真核生物體內(nèi)一段序列兩翼若存在重復(fù)序列，這段序列往往被刪除的現(xiàn)象[6]。由此，本研究選擇N蛋白作為刪除目標(biāo)，試圖構(gòu)建一種突變?nèi)LcDNA克隆，轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，初期能拯救出病毒，隨著傳代次數(shù)的增多，由于N蛋白被逐步刪除緣故，病毒最終死亡。雖有文獻(xiàn)表明刪除序列大小與正向重復(fù)序列大小呈正相關(guān)[6]，但是PRRSV作為載體允許插入外源序列長短有限[7，8]。因此，本研究首先分別在N蛋白兩端插入相同的35個(gè)核苷酸，構(gòu)建兩個(gè)全長cDNA克隆，然后在這兩個(gè)全長cDNA克隆都能拯救出相應(yīng)突變病毒的前提下，又在N蛋白兩端同時(shí)插入這35個(gè)核苷酸，構(gòu)建一個(gè)全長cDNA克隆，另外，本研究還構(gòu)建了一個(gè)突變體，其N蛋白兩端不僅同時(shí)插入這35個(gè)核苷酸，且N蛋白起始密碼子ATG突變成ACG。本研究成功獲得了以上4個(gè)全長cDNA克隆，并對它們進(jìn)行了病毒拯救與遺傳穩(wěn)定性特性分析。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒

Marc-145、PRRSV全長感染性克隆pAPRRS[4]、強(qiáng)毒株全長感染性克隆pJXM143[5]以及p7PA3[9]、p7AX12由本研究室保存。細(xì)胞生長液為含10%胎牛血清（FBS，Gibco-BRL Cat# 16000）的DMEM（Gibco-BRL Cat# 12430），維持液為含2% FBS的DMEM。Top10感受態(tài)細(xì)胞購自TIANGEN公司。

1.2 主要試劑

轉(zhuǎn)染試劑FuGENE？誖 HD購自Roche公司，PfuTurbo？誖 Hotstart DNA Polymerase購自Stratagene公司， QIAprep Spin Miniprep kit、QIAgen Viral RNA Mini Kit購自QIAGEN公司，AMV、rTaq購自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶購自NEB公司， lexa Fluor？誖 568或者FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗購自Invitrogen公司，免疫熒光試驗(yàn)所用北美型PRRSV 抗N蛋白單克隆抗體由南達(dá)科他州立大學(xué)（South Dakota state university）方英博士惠贈(zèng)。

1.3 引物

參照PRRSV弱毒株APRRS株（GeneBank登陸號：GQ330474）和強(qiáng)毒株JXM143株（GeneBank登錄號：EF488048）病毒基因組序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.4 全長突變體的構(gòu)建

以強(qiáng)毒株JXM143基因組為模板，用pfuTurbo？誖 Hotstart DNA Polymerase擴(kuò)增，通過突變PCR法獲得含有在強(qiáng)毒株JX143 ORF7前加入35 nt（TTAATTAA

CCGGCGGCGCGCCACCATGCCGAACAA，下劃線堿基

為酶切位點(diǎn)，斜體為M蛋白與N蛋白間的重疊序列），然后借助p7PA3具有的酶切位點(diǎn)把目的片段替換到p7PA3中，構(gòu)建pBJ327；通過兩輪重疊延伸PCR技術(shù)（Gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR）方法擴(kuò)增出在強(qiáng)毒株JX143 N蛋白后加入35 nt（與N蛋白前加入的35 nt一致），隨后把目的片段連入topo載體中，構(gòu)建中間質(zhì)粒topo-732，然后將成功構(gòu)建的質(zhì)粒topo-732與全長質(zhì)粒pAPRRS用SpeI/XhoI進(jìn)行雙酶切、再連接，構(gòu)建全長pBJ732質(zhì)粒。以上述構(gòu)建成功的質(zhì)粒topo-732為模板，通過突變PCR，獲得構(gòu)建全長pBJD32和 pBJD32R所需突變PCR 片段，并將此突變PCR片段連入topo載體中，構(gòu)建中間質(zhì)粒topo-D32和topo-D32R，最后將topo-D32、topo-D32R和pAPRRS用SpeI/XhoI雙酶切、再連接構(gòu)建全長突變體pBJD32和pBJD32R。并用部分測序方法鑒定獲得的全長突變體pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R。

1.5 轉(zhuǎn)染

用QIAprep Spin Miniprep kit（QIAgen Inc.）試劑盒提取全長突變體質(zhì)粒pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R，采用分光光度計(jì)測定各質(zhì)粒濃度，確定轉(zhuǎn)染量為1 μg DNA的轉(zhuǎn)染體積。接種Marc-145細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度約為80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑為FuGENE？誖HD，轉(zhuǎn)染后置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。待Marc-145細(xì)胞出現(xiàn)病變且病變達(dá)80%左右時(shí)收取細(xì)胞上清（P0病毒上清）保存于-70 ℃，并在Marc-145細(xì)胞連續(xù)傳代5次，將每代病毒保存于-70 ℃。

1.6 間接免疫熒光試驗(yàn)（Indirect immunofluorescence，IFA）

突變體質(zhì)粒pBJ327、pBJ732、pBJD32和 pBJD32R轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞72 h時(shí)，細(xì)胞經(jīng)冰甲醇固定10 min，1% BSA 封閉， 以抗PRRSV N蛋白的 MAb（1∶600）為一抗，羊抗鼠 IgG（1∶800）為二抗進(jìn)行IFA試驗(yàn)。具體操作見參考文獻(xiàn)[5]。

1.7 突變病毒基因組（genomic RNA，gRNA）的提取及鑒定

采用QIAamp Viral RNA試劑盒提取獲得的P5代突變病毒RNA。以提取的RNA為模板，SR15497為引物，用AMV反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。PCR反應(yīng)體系為25 μL：0.5 μL rTaq酶，10×PCR buffer 2.5 μL SF14413/SR15497為擴(kuò)增引物各1 μL，cDNA 1 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。獲得的突變病毒序列與PRRSV弱毒株APPRS株和強(qiáng)毒株JX143株進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個(gè)全長突變體構(gòu)建成功

根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]以及實(shí)驗(yàn)室的前期工作，本研究采用突變PCR在PRRSV N蛋白的兩端分別或同時(shí)插入35 nt，依次構(gòu)建了pBJ327、pBJ732、pBJD32、pBJD32R 4個(gè)全長cDNA，具體構(gòu)建示意圖見圖1。pBJD32、pBJD32R 兩個(gè)全長突變體的不同點(diǎn)是pBJD32R是在pBJD32基礎(chǔ)上將N蛋白的起始密碼子ATG突變成了ACG。以上突變體獲得全長后，經(jīng)測序分析表明均與最初設(shè)計(jì)一致，證明成功獲得了4個(gè)全長突變體。

2.2 全長突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)果

我們用FuGENE？誖 HD Transfection Reagent進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前先用QIAgen試劑盒抽提全長克隆質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染全長突變體劑量為1 μg。將Marc-145細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度約為80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染72 h時(shí)，IFA試驗(yàn)結(jié)果顯示，pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R均能在胞漿內(nèi)檢測到N蛋白（圖2）。pBJ327、pBJ732、pBJD32R轉(zhuǎn)染后4 d出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），而pBJD32轉(zhuǎn)染后7 d出現(xiàn)CPE（圖3）。拯救病毒分別命名為vBJ327、vBJ732、vBJD32、vBJD32R。結(jié)果表明，4個(gè)突變體轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后，均能表達(dá)N蛋白且能拯救出相應(yīng)的突變病毒，暗示突變病毒中的N蛋白在初期的拯救病毒中穩(wěn)定存在。另外，pBJD32R中的N蛋白起始密碼子的突變不影響突變病毒的拯救，暗示N蛋白使用的是引入的M蛋白與N蛋白重疊區(qū)中的起始密碼子ATG，這與Tan等[9]研究結(jié)果一致。

2.3 突變病毒基因組RT-PCR鑒定

將拯救病毒vBJ327、vBJ732、vBJD32、vBJD32R以低劑量感染MARC-145細(xì)胞，在MARC-145細(xì)胞上傳代5次，并對各代次病毒基因組進(jìn)行RT-PCR鑒定，結(jié)果見圖4。擴(kuò)增目的片斷為1 074 bp，將擴(kuò)增的目的片段與pBS-T載體相連，篩選陽性重組子送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，采用DNAStar軟件與親本感染性克隆pJXM143和pAPRRS進(jìn)行比對，結(jié)果所有嵌合病毒的基因序列均穩(wěn)定地存在于至少5代的子代嵌合病毒中，并未發(fā)現(xiàn)其他突變，具體序列比對見圖5。結(jié)果表明，獲得突變病毒經(jīng)系列傳代，并未出現(xiàn)N蛋白刪除的現(xiàn)象，且所有的突變位點(diǎn)都具有遺傳穩(wěn)定性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與p7AX12相比，在構(gòu)建pBJ327時(shí)，通過同義突變致使M蛋白/N蛋白間引入的M蛋白/N蛋白重疊序列與PRRSV本身的M蛋白/N蛋白重疊序列不完全重復(fù)，由此，推測pBJ327拯救的病毒vBJ327未出現(xiàn)外源序列刪除現(xiàn)象，而p7AX12拯救的突變病毒v7AX12中外源序列出現(xiàn)刪除現(xiàn)象，這可能與重復(fù)序列的重復(fù)程度相關(guān)，初步證明重復(fù)的序列必須完全一致，才能使重復(fù)序列間的序列被刪除。但本研究遺憾的是vBJD32和vBJD32R連續(xù)性傳代并未出現(xiàn)N蛋白刪除現(xiàn)象，推測出現(xiàn)刪除與否還可能與正向重復(fù)序列長度以及重復(fù)序列間的間隔序列長度相關(guān)。因此，在下一步試驗(yàn)將構(gòu)建含有不同長度的重復(fù)序列以及間隔序列長度不一的突變體來驗(yàn)證。本研究結(jié)果也為進(jìn)一步研究PRRSV亞基因組的不連續(xù)性轉(zhuǎn)錄機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[9]。

參考文獻(xiàn)：

[1] SNIJDER E J，MEULENBERG J J. The molecular biology of arteriviruses [J].J Gen Virol，1998（Pt 5），79：961-979.

[2] TIAN K，YU X，ZHAO T，et al. Emergence of fatal PRRSV variants：unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLoS ONE，2007，13：e526.

[3] YOO D，WELCH S K，LEE C，et al. Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and their potential as vaccine vectors[J].Vet immunol immunopathol，2004，102（3）：143-154.

[4] 袁世山，韋祖樟.PRRSV全長感染性cDNA克隆的構(gòu)建：非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白之間編碼區(qū)的分離[J].中國科學(xué)C輯：生命科學(xué)，2008，38（1）：66-73.

[5] 呂 健，孫 志，張建武，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染性克隆的構(gòu)建[J].微生物與感染，2007，2（4）：219-226.

[6] ANDREWS R M，GRIFFITHS P G，CHINNERY P F，et al. Evaluation of bupivacaine-induced muscle regeneration in the treatment of ptosis in patients with chronic progressive external ophthalmoplegia and Kearns-Sayre syndrome[J].Eye（Lond），1999， 13（Pt 6）：769-772.

[7] 李清清，姚 靜，韋祖樟.以PRRSV為載體表達(dá)外源基因的研究進(jìn)展[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2018，26（1）：89-93.

[8] 叢雁方.豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）蛋白編碼基因區(qū)的反向遺傳操作[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009.

[9] 譚菲菲，張 榮，韋祖樟，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白翻譯起始位點(diǎn)的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41（7）：847-853.