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        豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒M蛋白/N蛋白間與N蛋白/3

        2019-05-14 10:59:52鄭海紅孫竹筠叢雁方張可煜高飛童光志
        湖北畜牧獸醫(yī) 2019年3期
        關(guān)鍵詞:突變體毒株克隆

        鄭海紅 孫竹筠 叢雁方 張可煜 高飛 童光志

        摘要:為獲得一種經(jīng)全長cDNA突變體拯救出的、隨著傳代次數(shù)的增多而最終致死的突變病毒,以嵌合感染性克隆p7AX12為骨架,分別在豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)M蛋白與N蛋白間或(和)N蛋白/3'UTR之間插入32 nt,依次構(gòu)建4個(gè)嵌合突變體pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R,經(jīng)DNA轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后4個(gè)嵌合突變體均能拯救出病毒,且拯救病毒中的突變或插入的堿基具有遺傳穩(wěn)定性。突變病毒傳代5次,沒有最終致死的原因還有待于進(jìn)一步研究分析。獲得的4個(gè)突變病毒也為研制PRRSV基因標(biāo)識疫苗及PRRSV復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞:豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV);M蛋白/N蛋白;N蛋白/3'UTR;反向遺傳操作

        中圖分類號:S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1007-273X(2019)03-0010-04

        豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),是套式病毒目(Nidovirales)動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)成員之一[1]。該病毒引起的豬繁殖與呼吸障礙綜合征(PRRS)給中國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)都帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。一直以來,免疫接種是控制豬繁殖與呼吸障礙綜合征的惟一有效措施,但由于目前現(xiàn)有的PRRSV傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗各自存在不同程度弱點(diǎn),因此,高效安全的新型疫苗研發(fā)迫在眉睫[2]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對PRRSV認(rèn)識的不斷深入,尤其是反向遺傳操作技術(shù)[3,4]的發(fā)展,給豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒新型疫苗的研制帶來了極大希望。

        p7AX12(未發(fā)表質(zhì)粒)是以弱毒株pAPRRS[4]為母體,嵌合了強(qiáng)毒株JX143[5]的N蛋白,并且在基因組M蛋白/N蛋白間引入了外源序列(包括酶切位點(diǎn)、M蛋白與N蛋白重疊4個(gè)氨基酸),結(jié)果發(fā)現(xiàn),由p7AX12拯救的嵌合病毒v7AX12,在系列傳代過程中,基因組M蛋白/N蛋白間引入的外源序列不具有遺傳穩(wěn)定性,出現(xiàn)外源序列逐漸被刪除現(xiàn)象。推測刪除機(jī)制可能是引入的M蛋白與N蛋白重疊序列與PRRSV原本存在的這段序列存在序列重復(fù)從而導(dǎo)致了外源序列的刪除,此現(xiàn)象類似于真核生物體內(nèi)一段序列兩翼若存在重復(fù)序列,這段序列往往被刪除的現(xiàn)象[6]。由此,本研究選擇N蛋白作為刪除目標(biāo),試圖構(gòu)建一種突變?nèi)LcDNA克隆,轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞,初期能拯救出病毒,隨著傳代次數(shù)的增多,由于N蛋白被逐步刪除緣故,病毒最終死亡。雖有文獻(xiàn)表明刪除序列大小與正向重復(fù)序列大小呈正相關(guān)[6],但是PRRSV作為載體允許插入外源序列長短有限[7,8]。因此,本研究首先分別在N蛋白兩端插入相同的35個(gè)核苷酸,構(gòu)建兩個(gè)全長cDNA克隆,然后在這兩個(gè)全長cDNA克隆都能拯救出相應(yīng)突變病毒的前提下,又在N蛋白兩端同時(shí)插入這35個(gè)核苷酸,構(gòu)建一個(gè)全長cDNA克隆,另外,本研究還構(gòu)建了一個(gè)突變體,其N蛋白兩端不僅同時(shí)插入這35個(gè)核苷酸,且N蛋白起始密碼子ATG突變成ACG。本研究成功獲得了以上4個(gè)全長cDNA克隆,并對它們進(jìn)行了病毒拯救與遺傳穩(wěn)定性特性分析。

        1 材料與方法

        1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒

        Marc-145、PRRSV全長感染性克隆pAPRRS[4]、強(qiáng)毒株全長感染性克隆pJXM143[5]以及p7PA3[9]、p7AX12由本研究室保存。細(xì)胞生長液為含10%胎牛血清(FBS,Gibco-BRL Cat# 16000)的DMEM(Gibco-BRL Cat# 12430),維持液為含2% FBS的DMEM。Top10感受態(tài)細(xì)胞購自TIANGEN公司。

        1.2 主要試劑

        轉(zhuǎn)染試劑FuGENE?誖 HD購自Roche公司,PfuTurbo?誖 Hotstart DNA Polymerase購自Stratagene公司, QIAprep Spin Miniprep kit、QIAgen Viral RNA Mini Kit購自QIAGEN公司,AMV、rTaq購自TaKaRa公司,限制性內(nèi)切酶購自NEB公司, lexa Fluor?誖 568或者FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗購自Invitrogen公司,免疫熒光試驗(yàn)所用北美型PRRSV 抗N蛋白單克隆抗體由南達(dá)科他州立大學(xué)(South Dakota state university)方英博士惠贈(zèng)。

        1.3 引物

        參照PRRSV弱毒株APRRS株(GeneBank登陸號:GQ330474)和強(qiáng)毒株JXM143株(GeneBank登錄號:EF488048)病毒基因組序列,利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

        1.4 全長突變體的構(gòu)建

        以強(qiáng)毒株JXM143基因組為模板,用pfuTurbo?誖 Hotstart DNA Polymerase擴(kuò)增,通過突變PCR法獲得含有在強(qiáng)毒株JX143 ORF7前加入35 nt(TTAATTAA

        CCGGCGGCGCGCCACCATGCCGAACAA,下劃線堿基

        為酶切位點(diǎn),斜體為M蛋白與N蛋白間的重疊序列),然后借助p7PA3具有的酶切位點(diǎn)把目的片段替換到p7PA3中,構(gòu)建pBJ327;通過兩輪重疊延伸PCR技術(shù)(Gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)方法擴(kuò)增出在強(qiáng)毒株JX143 N蛋白后加入35 nt(與N蛋白前加入的35 nt一致),隨后把目的片段連入topo載體中,構(gòu)建中間質(zhì)粒topo-732,然后將成功構(gòu)建的質(zhì)粒topo-732與全長質(zhì)粒pAPRRS用SpeI/XhoI進(jìn)行雙酶切、再連接,構(gòu)建全長pBJ732質(zhì)粒。以上述構(gòu)建成功的質(zhì)粒topo-732為模板,通過突變PCR,獲得構(gòu)建全長pBJD32和 pBJD32R所需突變PCR 片段,并將此突變PCR片段連入topo載體中,構(gòu)建中間質(zhì)粒topo-D32和topo-D32R,最后將topo-D32、topo-D32R和pAPRRS用SpeI/XhoI雙酶切、再連接構(gòu)建全長突變體pBJD32和pBJD32R。并用部分測序方法鑒定獲得的全長突變體pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R。

        1.5 轉(zhuǎn)染

        用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAgen Inc.)試劑盒提取全長突變體質(zhì)粒pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R,采用分光光度計(jì)測定各質(zhì)粒濃度,確定轉(zhuǎn)染量為1 μg DNA的轉(zhuǎn)染體積。接種Marc-145細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞密度約為80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑為FuGENE?誖HD,轉(zhuǎn)染后置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。待Marc-145細(xì)胞出現(xiàn)病變且病變達(dá)80%左右時(shí)收取細(xì)胞上清(P0病毒上清)保存于-70 ℃,并在Marc-145細(xì)胞連續(xù)傳代5次,將每代病毒保存于-70 ℃。

        1.6 間接免疫熒光試驗(yàn)(Indirect immunofluorescence,IFA)

        突變體質(zhì)粒pBJ327、pBJ732、pBJD32和 pBJD32R轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞72 h時(shí),細(xì)胞經(jīng)冰甲醇固定10 min,1% BSA 封閉, 以抗PRRSV N蛋白的 MAb(1∶600)為一抗,羊抗鼠 IgG(1∶800)為二抗進(jìn)行IFA試驗(yàn)。具體操作見參考文獻(xiàn)[5]。

        1.7 突變病毒基因組(genomic RNA,gRNA)的提取及鑒定

        采用QIAamp Viral RNA試劑盒提取獲得的P5代突變病毒RNA。以提取的RNA為模板,SR15497為引物,用AMV反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。PCR反應(yīng)體系為25 μL:0.5 μL rTaq酶,10×PCR buffer 2.5 μL SF14413/SR15497為擴(kuò)增引物各1 μL,cDNA 1 μL,補(bǔ)充ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。獲得的突變病毒序列與PRRSV弱毒株APPRS株和強(qiáng)毒株JX143株進(jìn)行比對分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 4個(gè)全長突變體構(gòu)建成功

        根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]以及實(shí)驗(yàn)室的前期工作,本研究采用突變PCR在PRRSV N蛋白的兩端分別或同時(shí)插入35 nt,依次構(gòu)建了pBJ327、pBJ732、pBJD32、pBJD32R 4個(gè)全長cDNA,具體構(gòu)建示意圖見圖1。pBJD32、pBJD32R 兩個(gè)全長突變體的不同點(diǎn)是pBJD32R是在pBJD32基礎(chǔ)上將N蛋白的起始密碼子ATG突變成了ACG。以上突變體獲得全長后,經(jīng)測序分析表明均與最初設(shè)計(jì)一致,證明成功獲得了4個(gè)全長突變體。

        2.2 全長突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)果

        我們用FuGENE?誖 HD Transfection Reagent進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前先用QIAgen試劑盒抽提全長克隆質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染全長突變體劑量為1 μg。將Marc-145細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞密度約為80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染72 h時(shí),IFA試驗(yàn)結(jié)果顯示,pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R均能在胞漿內(nèi)檢測到N蛋白(圖2)。pBJ327、pBJ732、pBJD32R轉(zhuǎn)染后4 d出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE),而pBJD32轉(zhuǎn)染后7 d出現(xiàn)CPE(圖3)。拯救病毒分別命名為vBJ327、vBJ732、vBJD32、vBJD32R。結(jié)果表明,4個(gè)突變體轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后,均能表達(dá)N蛋白且能拯救出相應(yīng)的突變病毒,暗示突變病毒中的N蛋白在初期的拯救病毒中穩(wěn)定存在。另外,pBJD32R中的N蛋白起始密碼子的突變不影響突變病毒的拯救,暗示N蛋白使用的是引入的M蛋白與N蛋白重疊區(qū)中的起始密碼子ATG,這與Tan等[9]研究結(jié)果一致。

        2.3 突變病毒基因組RT-PCR鑒定

        將拯救病毒vBJ327、vBJ732、vBJD32、vBJD32R以低劑量感染MARC-145細(xì)胞,在MARC-145細(xì)胞上傳代5次,并對各代次病毒基因組進(jìn)行RT-PCR鑒定,結(jié)果見圖4。擴(kuò)增目的片斷為1 074 bp,將擴(kuò)增的目的片段與pBS-T載體相連,篩選陽性重組子送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序,采用DNAStar軟件與親本感染性克隆pJXM143和pAPRRS進(jìn)行比對,結(jié)果所有嵌合病毒的基因序列均穩(wěn)定地存在于至少5代的子代嵌合病毒中,并未發(fā)現(xiàn)其他突變,具體序列比對見圖5。結(jié)果表明,獲得突變病毒經(jīng)系列傳代,并未出現(xiàn)N蛋白刪除的現(xiàn)象,且所有的突變位點(diǎn)都具有遺傳穩(wěn)定性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),與p7AX12相比,在構(gòu)建pBJ327時(shí),通過同義突變致使M蛋白/N蛋白間引入的M蛋白/N蛋白重疊序列與PRRSV本身的M蛋白/N蛋白重疊序列不完全重復(fù),由此,推測pBJ327拯救的病毒vBJ327未出現(xiàn)外源序列刪除現(xiàn)象,而p7AX12拯救的突變病毒v7AX12中外源序列出現(xiàn)刪除現(xiàn)象,這可能與重復(fù)序列的重復(fù)程度相關(guān),初步證明重復(fù)的序列必須完全一致,才能使重復(fù)序列間的序列被刪除。但本研究遺憾的是vBJD32和vBJD32R連續(xù)性傳代并未出現(xiàn)N蛋白刪除現(xiàn)象,推測出現(xiàn)刪除與否還可能與正向重復(fù)序列長度以及重復(fù)序列間的間隔序列長度相關(guān)。因此,在下一步試驗(yàn)將構(gòu)建含有不同長度的重復(fù)序列以及間隔序列長度不一的突變體來驗(yàn)證。本研究結(jié)果也為進(jìn)一步研究PRRSV亞基因組的不連續(xù)性轉(zhuǎn)錄機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[9]。

        參考文獻(xiàn):

        [1] SNIJDER E J,MEULENBERG J J. The molecular biology of arteriviruses [J].J Gen Virol,1998(Pt 5),79:961-979.

        [2] TIAN K,YU X,ZHAO T,et al. Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLoS ONE,2007,13:e526.

        [3] YOO D,WELCH S K,LEE C,et al. Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and their potential as vaccine vectors[J].Vet immunol immunopathol,2004,102(3):143-154.

        [4] 袁世山,韋祖樟.PRRSV全長感染性cDNA克隆的構(gòu)建:非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白之間編碼區(qū)的分離[J].中國科學(xué)C輯:生命科學(xué),2008,38(1):66-73.

        [5] 呂 健,孫 志,張建武,等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染性克隆的構(gòu)建[J].微生物與感染,2007,2(4):219-226.

        [6] ANDREWS R M,GRIFFITHS P G,CHINNERY P F,et al. Evaluation of bupivacaine-induced muscle regeneration in the treatment of ptosis in patients with chronic progressive external ophthalmoplegia and Kearns-Sayre syndrome[J].Eye(Lond),1999, 13(Pt 6):769-772.

        [7] 李清清,姚 靜,韋祖樟.以PRRSV為載體表達(dá)外源基因的研究進(jìn)展[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2018,26(1):89-93.

        [8] 叢雁方.豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)蛋白編碼基因區(qū)的反向遺傳操作[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2009.

        [9] 譚菲菲,張 榮,韋祖樟,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白翻譯起始位點(diǎn)的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,41(7):847-853.

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