陳霽暉，顧芬芬，李 超，林志燕，黃曉會，劉 艷

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院 藥學部，上海 200092

乳腺癌是繼肺癌之后全球發(fā)病率最高的腫瘤，也是導致女性患癌死亡最重要的原因[1]。乳腺癌的發(fā)病率逐年升高，我國2014年女性乳腺癌新發(fā)病例約27.89萬例，占女性惡性腫瘤發(fā)病的16.51%，居女性惡性腫瘤發(fā)病率首位[2]。目前乳腺癌的治療以手術方式為主，但術后的抗腫瘤化療也非常重要。臨床上的化療藥物眾多，其作用機制和效果不盡相同，其中鉑類藥物是抗癌藥物中重要的一類，現(xiàn)已用于乳腺癌、尤其是三陰乳腺癌患者的化療。由于人體間的個體差異以及腫瘤細胞普遍對化療藥物產(chǎn)生的耐藥現(xiàn)象，均會影響藥物的療效，因此在體外對抗癌藥物進行篩選非常有意義。MTT法作為一種檢測藥物對腫瘤細胞增殖影響的方法，是目前腫瘤患者體外藥物藥敏性篩選的常規(guī)方法之一[3]。

三磷酸腺苷結合盒 （ATP-binding cassette，ABC）跨膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族異常表達，是腫瘤細胞耐藥性形成的重要原因，也是目前逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥的研究焦點。ABC跨膜轉(zhuǎn)運體家族的一些成員可以利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將化療藥物轉(zhuǎn)運到細胞外，降低細胞內(nèi)的藥物濃度，減弱化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用，導致細胞耐藥性的產(chǎn)生。其中與腫瘤耐藥最密切相關也是研究最多是：ABCB1（multidrug resistance 1，MDR1/P-gp/PGY1）、ABCG2（breast cancer resistance protein，BCRP）以及 ABCC家族中的9種多藥耐藥相關蛋白 （multidrug resistance protein，MRPs）[4，5]。

本文采用MTT法對人乳腺癌樣本進行體外藥物敏感性試驗，通過檢測3種鉑類藥物 （順鉑、卡鉑、奧沙利鉑）對腫瘤細胞體外增殖的影響，測定藥物對腫瘤細胞的抑制率。結合腫瘤細胞的11種與耐藥密切相關的ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達水平，研究耐藥轉(zhuǎn)運蛋白基因表達水平與腫瘤細胞對鉑類藥物耐藥的關系。

1 材料與方法

1.1 標本

取2014年4月～2015年12月就診于本院的34例乳腺癌患者的新鮮腫瘤組織，術后標本均經(jīng)病理證實為乳腺癌?；颊呔鶠榕?，年齡33～79歲，中位年齡59歲。所有患者均為首次治療，術前未化療。標本于無菌條件下浸于生理鹽水中、并快速送至無菌實驗室。

1.2 腫瘤細胞懸液制備

取腫瘤組織標本，用RPMI-1640培養(yǎng)液 （含10%小牛血清和青霉素 100 U·mL-1、鏈霉素 100 μg·mL-1）反復沖洗，剪除脂肪、纖維及壞死組織，選取邊緣生長好、無壞死的腫瘤組織小塊，無菌剪刀剪成糊狀，然后將剪碎的組織和細胞培養(yǎng)液倒入篩孔內(nèi)徑（150±6.6）μm 的不銹鋼篩中，研磨、過濾，制成細胞懸液。將細胞懸液離心 10 min（1 500 r·min-1），用培養(yǎng)液清洗2次。離心后用細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，用培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度約5×105個/mL。

1.3 MTT藥物敏感試驗

采用96孔板培養(yǎng)，設3組：用藥組、對照組、空白組。用藥組中每孔加入鉑類藥物10 μL（順鉑：1.00mg·mL-1，卡鉑：0.50mg·mL-1，奧沙利鉑：0.24mg·mL-1）和細胞懸液 90 μL。每組藥物設 3 個復孔，藥物終濃度等于藥物1次快速靜脈注射后理論最高血藥濃度；對照組不加藥，加入細胞懸液90 μL；空白組不加藥，加入培養(yǎng)液90 μL。將加完樣的96孔板置于培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。每孔中分別加 5 mg·mL-1MTT 20 μL， 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。每孔加10%SDS 100 μL溶解沉淀并終止反應。16～18 h后用酶標儀在570 nm（630 nm參比波長）波長處檢測光密度值（吸光度值A）。取3復孔的吸光度平均值作為細胞在此藥物組的平均吸光度值。

腫瘤細胞抑制率 （%）=（對照組吸光度值-用藥組平均吸光度值）/（對照孔平均吸光度值-空白組吸光度值）×100%；判斷標準：腫瘤細胞抑制率>30%為敏感；<30%為耐藥。

1.4 實時熒光定量PCR法測定腫瘤組織ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達水平

腫瘤細胞的總RNA提取采用Invitrogen公司的 TRIZOL reagent kit；cDNA逆轉(zhuǎn)錄采用 Applied Biosystem公司的High Capacity cDNA Archive Kit；qRT-PCR采用 Bio-Rad公司的 MyiQTM Single-Color Real-Time PCR Detection System和AB science公司的HotStart-IT SYBR Green One-Step qRT-PCR Master Mix Kits。以18S rRNA的表達為內(nèi)標；基因的mRNA表達水平表示為2-△△CT。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS24.0軟件處理，基因表達水平以均數(shù)±標準差）表示，采用t檢驗做兩組間差異顯著性分析，spearman秩相關性分析做兩變量間的相關性分析，r絕對值大于0.5視為有較強的相關程度。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 體外藥敏試驗結果與ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因表達的關系

檢測的11種與腫瘤耐藥相關的ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白、在34例乳腺癌患者腫瘤細胞中的表達如下（×10-3/18S rRNA）：ABCB1：5.51±0.95；ABCG2：132.6±20.8；ABCC1：5.50±1.38；ABCC2：2.40±0.46；ABCC3：16.4 ±2.59；ABCC4：8.58 ±2.11；ABCC5：27.6 ±4.31；ABCC6：5.65±1.65；ABCC10：3.24±1.09；ABCC11：2.39±0.53；ABCC12：13.8±3.55。3 種鉑類藥物對 34 例乳腺癌患者腫瘤細胞的平均抑制率為：順鉑：43.35%；卡鉑：38.87%；奧沙利鉑：40.52%。

表1 體外藥敏試驗敏感組與耐藥組中ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因表達水平比較（×10-3/18S rRNA）

如表1所示，ABCB1的mRNA含量在順鉑、卡鉑耐藥組明顯高于敏感組，ABCG2的mRNA含量在順鉑耐藥組明顯高于敏感組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。其余基因表達高低在鉑類藥物敏感組與耐藥組之間無顯著差異。

2.2 乳腺癌組織中ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因表達水平與鉑類藥物體外抑制率的關系

在乳腺癌組織中，ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因表達水平與鉑類藥物體外抑制率的關系見表2。

從表2發(fā)現(xiàn)，順鉑對乳腺癌細胞的抑制率與ABCB1（r=-0.51，P<0.01）和 ABCC6（r=-0.55，P<0.01）的表達水平有明顯相關性，且相關程度較強。與ABCG2（r=-0.49，P<0.01）、ABCC5（r=-0.41，P<0.05）、ABCG11（r=-0.38，P<0.05）和 ABCC12（r=-0.36，P<0.05）的表達也呈顯著負相關。其中ABCB1的表達水平與順鉑對腫瘤的抑制率關系見圖1-A；ABCC6的表達水平與順鉑對腫瘤的抑制率關系見圖1-B。

表2 ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因表達水平與順鉑、卡鉑、奧沙利鉑對腫瘤組織抑制率的相關性分析（n=34）

2.3 乳腺癌組織中ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因表達水平與卡鉑體外抑制率的關系

如表2所示，發(fā)現(xiàn)卡鉑對乳腺癌細胞的抑制率與 ABCB1（r=-0.51，P<0.01）的表達水平有明顯相關性，且相關程度較強。與 ABCC1（r=-0.35，P<0.05）和ABCC6（r=-0.46，P<0.05）的表達也呈顯著負相關。ABCB1的表達水平與卡鉑對腫瘤的抑制率關系見圖1-C。

2.4 乳腺癌組織中ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因表達水平與奧沙利鉑體外抑制率的關系

如表2所示，發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑對乳腺癌細胞的抑制率與ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達水平均無明顯相關性。

圖1 ABCB1的表達水平與順鉑對腫瘤組織抑制率的關系（A）、ABC C6的表達水平與順鉑對腫瘤組織抑制率的關系（B）和ABCB1的表達水平與卡鉑對腫瘤組織抑制率的關系（C）

3 討 論

隨著研究的深入，人們對乳腺癌的認識不斷加深，治療手段日益增多。不過目前手術治療仍是乳腺癌首選的治療方式，但是化療作為乳腺癌術后必不可少的一種輔助治療，對于乳腺癌的根治以及降低復發(fā)率都有著重要的作用。由于腫瘤存在一定的異質(zhì)性，不同個體之間的差異以及藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運酶等基因的多態(tài)性和表達差異，導致個體對腫瘤藥物的敏感性也有很大的差異。因此研究不同個體腫瘤的生物學特性及對化療藥物的敏感性差異具有重要的實用價值。MTT法是一種成熟、簡便、快捷、靈敏的體外測定藥物敏感性的方法。本研究采用MTT法分析了34例乳腺癌患者的腫瘤細胞對3種鉑類藥物（順鉑、卡鉑、奧沙利鉑）的敏感性，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者間存在著明顯的個體差異。同時，檢測了腫瘤細胞的11種與耐藥密切相關的ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達水平，結合其MTT的藥敏結果，分析研究耐藥轉(zhuǎn)運蛋白表達水平與腫瘤細胞對鉑類藥物耐藥的關系。

目前研究發(fā)現(xiàn)，在人類中至少有48種ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，其中多種參與了腫瘤細胞多藥耐藥的形成。在ABC跨膜轉(zhuǎn)運體家族中，ABCB1、ABCG2以及ABCC家族中9種多藥耐藥相關蛋白（MRPs）是與腫瘤多藥耐藥最密切的ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白[4，5]。ABCB1是一種與耐藥有關的細胞膜糖蛋白，生理狀態(tài)下其能夠?qū)C體的毒素和外源性物質(zhì)轉(zhuǎn)運出細胞，起到保護作用。在許多血液系統(tǒng)腫瘤和實體腫瘤中，如乳腺癌、口腔上皮麟癌、卵巢癌等，ABCB1原發(fā)性過表達。過表達的ABCB1轉(zhuǎn)運體主動將腫瘤細胞內(nèi)的化療藥物泵出，使腫瘤細胞內(nèi)化療藥物蓄積減少，從而產(chǎn)生耐藥[6，7]。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者化療后，ABCB1陽性的患者對化療反應較差，5年生存率明顯降低[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，ABCB1在乳腺癌順鉑和卡鉑的敏感組和耐藥組之間的表達水平均有統(tǒng)計學差異，且在乳腺癌組織中ABCB1基因表達水平與順鉑、卡鉑對腫瘤細胞的體外抑制率呈現(xiàn)負相關，說明ABCB1的高表達會導致乳腺癌細胞對順鉑、卡鉑的耐藥。

ABCG2最早在多柔比星耐藥的乳腺癌細胞系中被發(fā)現(xiàn)，因此也稱作乳腺癌耐藥蛋白。其同樣具有藥物排出泵功能[9]，過表達可以導致多種腫瘤細胞對化療藥物如鉑類、蒽環(huán)類藥物的耐藥[10，11]。本研究顯示，ABCG2在乳腺癌細胞中高表達，其在敏感組和耐藥組之間的表達水平有統(tǒng)計學差異，且基因表達水平與順鉑對腫瘤細胞的體外抑制率呈現(xiàn)負相關，說明ABCG2的高表達會導致乳腺癌細胞對順鉑的耐藥。而在卡鉑或奧沙利鉑給藥組中，沒有觀察到類似的相關性。

ABCC蛋白家族是由ABCC基因編碼的，目前已發(fā)現(xiàn)了13種ABCC家族的成員，其中9種與藥物耐藥性有關，命名為 MRP1～MRP9：ABCC1（MRP1）、ABCC2 （MRP2）、ABCC3 （MRP3）、ABCC4（MRP4）、ABCC5 （MRP5）、ABCC6 （MRP6）、ABCC10（MRP7）、ABCC11（MRP8）、ABCC12（MRP9）。MRPs蛋白依靠ATP供能，轉(zhuǎn)運內(nèi)源性物質(zhì)或抗腫瘤藥物，使得胞內(nèi)藥物的有效濃度降低，從而導致腫瘤細胞耐藥。目前研究發(fā)現(xiàn)，MRP家族的成員介導多種腫瘤細胞對化療藥物耐藥[12]。其中ABCC6最早是在表阿霉素耐藥的人白血病細胞中發(fā)現(xiàn)的[13]。其在肝臟和腎臟中高表達，但在其他各種組織中也有表達。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，中國倉鼠卵巢細胞過表達ABCC6會對順鉑、依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素等抗腫瘤藥物耐藥，但其在臨床腫瘤耐藥中的研究較少[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在9種MRP家族成員中，ABCC5、ABCC6、ABCC11和ABCC12的基因表達水平與順鉑對腫瘤細胞的體外抑制率呈現(xiàn)負相關，其中ABCC6與抑制率的負相關程度最大，說明MRP家族的多個蛋白高表達都有可能會導致乳腺癌細胞對順鉑的耐藥。對于卡鉑而言，ABCC1和ABCC6的表達水平與其對腫瘤細胞的抑制率也有負相關性。而MRP家族成員的表達都沒有發(fā)現(xiàn)與奧沙利鉑耐藥有顯著相關性。

在3種鉑類藥物中，順鉑的分子量最小、結構最簡單，而奧沙利鉑的結構最復雜，藥物結構上的差別可能導致了轉(zhuǎn)運體對其作用的差異。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，在ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白家族中，多個蛋白的高表達與順鉑、卡鉑的耐藥有關，其中ABCB1的高表達與藥物耐藥的關系最為顯著。針對這些靶點的新藥物的研發(fā)，有望提高乳腺癌的化療效果。本文是基于34例乳腺癌患者的研究結果，今后還需擴大樣本量或增加藥物種類作進一步的研究。