蘇日娜，樊萬君，姚 靜

中國(guó)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，南京 210009

磷酸鋁凝膠是一種抗酸劑，能中和胃酸，使胃內(nèi)pH升高，從而緩解胃酸過多引起的反酸、十二指腸潰瘍等癥狀。凝膠劑中的磷酸鋁能形成膠體保護(hù)性薄膜，從而隔離并保護(hù)損傷組織。有報(bào)道稱，選擇膠體次枸櫞酸鉍為對(duì)照品、128名患者的臨床治療研究顯示，磷酸鋁凝膠能提高胃內(nèi)pH值至3，胃腸道副作用少，成功緩解胃痛、反酸、燒心的案例所占比分別為90.7%、94.2%和89.7%，有效緩解各癥狀總比率為85%[1]。然而，目前國(guó)內(nèi)對(duì)于其在胃腸道中的分布研究未見報(bào)道。

小動(dòng)物活體熒光成像技術(shù)可以實(shí)時(shí)、無損、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)標(biāo)記物在活體小動(dòng)物體內(nèi)的分布等[2，3]。相比其他檢測(cè)藥物濃度、組織切片等考察藥物分布的方法，熒光成像法更加直觀且方便。本實(shí)驗(yàn)采用熒光成像技術(shù)研究磷酸鋁凝膠（潔維樂?）在禁食小鼠的離體胃腸道中的分布情況，為胃腸道分布研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷酸鋁凝膠（潔維樂?）購(gòu)自韓國(guó)保寧制藥株式會(huì)社；深紅色碘化物熒光探針DiR購(gòu)自北京富百科生物技術(shù)有限公司；熒光探針菁染料琥珀酰亞胺酯Cy5購(gòu)自西安瑞禧生物科技有限公司；水合氯醛購(gòu)自永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司。

VISQUE In Vivo Elite小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)（Korea）用于熒光成像；分析軟件為CleVue。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小白鼠，雄性，體重為25～32 g，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，許可證號(hào)SCXK（蘇）2017-0001。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食 15 h（自由飲水）。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)小鼠的處置按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，符合動(dòng)物倫理學(xué)。

1.3 潔維樂標(biāo)記物制備

根據(jù)潔維樂說明書，口服用量為一次20～40g凝膠，換算成小鼠灌胃等效劑量為2.5999～5.1997g·kg-1。

根據(jù)小鼠體重，精密稱取5.1997g·kg-1潔維樂至1mL注射器中，在避光條件下精密加入300 μg·kg-1Cy5（2 mg·mL-1的 DMSO 溶液）或 DiR（10 mg·mL-1的DMSO溶液），與潔維樂混勻即得潔維樂標(biāo)記物。

1.4 熒光探針的篩選

取禁食小鼠4只，稱重，隨機(jī)分為2組（n=2），分別灌胃給予潔維樂DiR標(biāo)記物和潔維樂Cy5標(biāo)記物，計(jì)時(shí)。在灌胃后24 h麻醉小鼠，分別進(jìn)行小鼠在體熒光成像；隨后立即處死，分別打開腹腔后、取出胃腸道進(jìn)行熒光成像。熒光成像參數(shù)為：DiR組激發(fā)波長(zhǎng)為740～790帶通，發(fā)射波長(zhǎng)為810～860 nm長(zhǎng)通，曝光時(shí)間1 s；Cy5組激發(fā)波長(zhǎng)為630～680帶通，發(fā)射波長(zhǎng)為690～740nm長(zhǎng)通，曝光時(shí)間1s。

1.5 考察潔維樂Cy5標(biāo)記物在小鼠離體胃腸道中的熒光成像情況

取禁食小鼠30只，稱重，隨機(jī)分為6組（n=5），灌胃給予潔維樂Cy5標(biāo)記物，計(jì)時(shí)。以非標(biāo)記給藥組為平行對(duì)照， 在灌胃后于 0.5、2、4、8、12、24 h 處死小鼠，取出胃腸道，采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光成像，熒光成像參數(shù)同“1.4”項(xiàng)Cy5組。

1.6 考察潔維樂Cy5標(biāo)記物在小鼠其他器官（心脾肝腎肺）中的分布情況

禁食小鼠灌胃給予潔維樂Cy5標(biāo)記物在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行胃腸道熒光成像后，同時(shí)取出小鼠的其他器官（心脾肝腎肺），采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)在相同條件下進(jìn)行熒光成像。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 熒光探針的篩選

分別灌胃給予潔維樂DiR標(biāo)記物和潔維樂Cy5標(biāo)記物的兩組小鼠，在24 h時(shí)觀察在體、開腹腔和離體胃腸道熒光成像情況，見圖1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由于成像深度有限[4]，在考察限度下，兩組均未觀察到小鼠在體熒光成像情況；而潔維樂Cy5標(biāo)記物組可更明顯觀察到小鼠開腹腔及離體胃腸道中的熒光成像，故選擇Cy5作為熒光探針。

2.2 考察潔維樂Cy5標(biāo)記物在小鼠離體胃腸道中的熒光成像情況

圖1 DiR和Cy5潔維樂標(biāo)記物分別灌胃給藥小鼠在24h時(shí)的熒光成像圖

灌胃潔維樂Cy5標(biāo)記物和平行對(duì)照組的小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的離體胃腸道熒光成像情況，見圖2。

圖2 灌胃Cy5潔維樂標(biāo)記物的小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的離體胃腸道熒光成像圖（n=5）

熒光標(biāo)尺從藍(lán)色至紅色代表熒光信號(hào)由弱至強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.5h時(shí)潔維樂Cy5標(biāo)記物已進(jìn)入腸道內(nèi)，2h開始進(jìn)入盲腸和結(jié)腸，表明潔維樂在2 h可分布至胃腸道各部位，此后胃、小腸紅色熒光信號(hào)開始變?nèi)酰? h開始盲腸和結(jié)腸呈現(xiàn)強(qiáng)烈紅色熒光信號(hào)，8 h后盲腸和結(jié)腸紅色熒光信號(hào)減弱，24 h時(shí)各部位熒光信號(hào)均降至最弱。胃內(nèi)熒光信號(hào)隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈減弱趨勢(shì)，在0.5 h呈強(qiáng)烈紅色熒光信號(hào)，24 h呈藍(lán)色弱信號(hào)或基本無信號(hào)；盲腸及結(jié)腸內(nèi)熒光在0.5 h幾乎沒有熒光信號(hào)，隨后呈現(xiàn)先增強(qiáng)為紅色強(qiáng)烈熒光信號(hào)、而后減弱。

將小鼠離體胃腸道熒光成像圖作進(jìn)一步分析，采用分析軟件Clevue計(jì)算各部位平均熒光強(qiáng)度，繪制胃腸道各部位（胃、小腸、盲腸、結(jié)腸）的熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線圖（見圖3）及堆積百分圖（見圖4）。

圖3 灌胃Cy5潔維樂標(biāo)記物的小鼠胃腸道（胃、小腸、盲腸、結(jié)腸）內(nèi)熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線圖*P<0.05，**P<0.01

圖4 灌胃Cy5潔維樂標(biāo)記物的小鼠胃腸道（胃、小腸、盲腸、結(jié)腸）內(nèi)熒光強(qiáng)度堆積百分比-時(shí)間圖

從圖3可知，潔維樂Cy5標(biāo)記物的小鼠胃內(nèi)熒光強(qiáng)度曲線顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而呈減弱的趨勢(shì)，這是由于潔維樂Cy5標(biāo)記物灌胃后達(dá)到最大量并逐漸進(jìn)入腸道，因而呈減弱趨勢(shì)；小腸內(nèi)熒光強(qiáng)度曲線則是0.5h即顯示較大熒光強(qiáng)度，且在0.5～2h點(diǎn)持續(xù)增強(qiáng)，而2 h后開始逐漸減弱，可以表明潔維樂Cy5標(biāo)記物在0.5 h已經(jīng)開始進(jìn)入腸道，且前2 h持續(xù)推進(jìn)至腸道內(nèi)分布，而2 h后逐漸進(jìn)入盲腸和結(jié)腸處，從而呈減弱趨勢(shì)；盲腸和結(jié)腸內(nèi)熒光強(qiáng)度在0.5h時(shí)幾乎忽略不計(jì)，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增強(qiáng)后減弱，可說明潔維樂Cy5標(biāo)記物0.5 h還未到達(dá)盲腸和結(jié)腸，隨后持續(xù)進(jìn)入盲腸和結(jié)腸而增強(qiáng)，再逐漸排出體外而呈減弱趨勢(shì)。

圖4結(jié)果顯示，潔維樂Cy5標(biāo)記物在2 h時(shí)基本分布至小鼠胃腸道各部位；0.5 h時(shí)，胃及小腸所占分布比率最大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，而盲腸及結(jié)腸部位分布比率持續(xù)上升，至24 h時(shí)主要分布在盲腸及結(jié)腸部位然而，在24 h胃腸道各部位仍有不同程度的潔維樂分布。

2.3 考察潔維樂標(biāo)記物在小鼠其他器官（心脾肝腎肺）中的分布情況

灌胃用Cy5標(biāo)記的潔維樂小鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行熒光成像后，取出小鼠的其他器官（心脾肝腎肺）進(jìn)行熒光成像。結(jié)果顯示，灌胃潔維樂Cy5標(biāo)記物的小鼠其他上述器官內(nèi)均未見熒光顯示，見圖5。

3 討 論

近年來，熒光成像技術(shù)在監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[5]、生物體內(nèi)特定基因的表達(dá)[6]、靶向藥物治療效果評(píng)價(jià)[7]等方面，具有廣泛的應(yīng)用前景。在口服藥物胃腸道分布研究中，小動(dòng)物活體熒光成像會(huì)有生物組織深度限制和各個(gè)小鼠胃腸道在腹腔的位置偏差，而對(duì)分布研究有所干擾，因此，選擇離體胃腸道熒光成像，以避免生物組織深度限制，同時(shí)達(dá)到直觀、實(shí)時(shí)地觀察藥物在體內(nèi)的分布及停留情況。

本研究基于小鼠體重范圍在30 g左右而導(dǎo)致潔維樂給藥量基本不大于0.2 g，加之灌胃操作時(shí)的平行殘留量不可避免，最終選擇較大的灌胃給藥量5.1997g·kg-1，以減小給藥偏差。潔維樂為黃白色凝膠，與水及其他溶劑混合變成混懸液，并緩慢沉淀。因此，制備標(biāo)記物時(shí)，先將熒光染料溶于二甲基亞砜配制成高濃度熒光染料母液，再根據(jù)小鼠體重精密移取300 μg·kg-1熒光染料母液，并與潔維樂混合，以減小溶劑對(duì)凝膠性質(zhì)的影響，保證潔維樂呈凝膠狀態(tài)。

本研究應(yīng)用小動(dòng)物在體熒光成像系統(tǒng)和熒光染料Cy5成功對(duì)磷酸鋁凝膠（潔維樂?）在禁食小鼠的胃腸道中的分布進(jìn)行了可視化示蹤，可為考察潔維樂胃腸道分布中提供參考。

圖5 灌胃Cy5潔維樂標(biāo)記物小鼠的其他器官（心脾肝腎肺）在不同時(shí)間點(diǎn)的熒光成像圖（n=5）