俞秋華，付喜梅，劉莉莉，楊寧

（四川省疾病預防控制中心，四川成都 610000）

手部消毒是預防致病菌傳播的簡單又有效的方法，因此，研究者們積極研發(fā)各種不同配方成分和含量的相關消毒劑，其中，三氯羥基二苯醚（2,4,4'-三氯-2'-羥基二苯醚，又稱三氯生）是一種高效的廣譜抗菌劑。手部消毒劑的形式多種多樣，隨著時代的進步，使用要求的全面提高，免洗手凝膠逐漸出現(xiàn)。某免洗消毒凝膠為無色透明凝膠狀液體，其中乙醇平均含量為61.6%（V/V），三氯羥基二苯醚平均含量為0.88%（V/V），pH均值為6.0。本研究經(jīng)由實驗室消毒試驗和現(xiàn)場試驗，全面評價該免洗消毒凝膠的消毒效果、安全性和使用舒適度，研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 消毒液

某品牌免洗手消毒凝膠，原液備用。

1.1.2 試驗菌株

大腸桿菌（8099）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、白色念珠菌（ATCC10231），由中國普通微生物菌種保藏中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、沙氏瓊脂。

1.1.4 中和劑

含0.5%硫代硫酸鈉、0.5%卵磷脂、1.0%甘氨酸、3.0%吐溫-80的PBS溶液。

1.1.5 采樣液

含0.1%吐溫-80的PBS緩沖液。

1.1.6 實驗動物

昆明種小鼠，四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-19.SPF級；健康大耳白兔，四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK[川]2013-14.普通級。

1.2 試驗方法

1.2.1 殺菌試驗方法[1]1.2.1.1 菌懸液的制備

用TSB分別洗下大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌在營養(yǎng)瓊脂斜面上經(jīng)過18 h培養(yǎng)的菌苔，混勻成菌懸液。用菌懸液制作菌片，晾干后使每片含菌量為 5.0×105～ 5.0×106。

1.2.1.2 中和劑載體定量鑒定試驗

按載體浸泡定量殺菌試驗的程序進行試驗。試驗3次重復均符合《消毒技術規(guī)范》（2002年版）的要求，則中和劑的成分及其濃度都合格。

1.2.1.3 載體浸泡定量殺菌試驗

將各菌片投入5.0 mL消毒液中（陽性對照組用PBS代替消毒液），分別作用至0.5 min、1.0 min、1.5 min時，無菌操作取出菌片投入中和劑試管內(nèi)，用手振敲80次，等待10 min，再混勻后，分別接種平皿，計數(shù)。試驗中使用的中和劑等試劑、培養(yǎng)基，接種平皿做陰性對照，分別計算各菌在各作用時間的殺滅對數(shù)值。

1.2.1.4 現(xiàn)場消毒試驗

選擇30名手部未經(jīng)處理的同事為受試者，雙手互相揉搓以均勻所帶自然菌的數(shù)量，左手手指并攏，用無菌棉簽蘸取稀釋液，擠干，往返涂擦所有手指部位2遍，期間轉(zhuǎn)動1次棉簽，無菌條件下將棉簽前段剪入中和劑管，充分混勻后接種平皿，計數(shù)，做陽性對照。按免洗手凝膠的說明書上的使用方法對右手消毒1.0 min后，用無菌棉簽蘸取中和劑進行采樣，接種平皿，計數(shù)，做試驗組。

1.2.2 毒性試驗[1]

1.2.2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗

取小鼠雌雄各半，禁食一晚，不禁水。采用一次最大限度試驗，劑量為5 000 mg/kg，稱取5.0 g樣品加蒸餾水至20 mL混勻后備用，給藥量按20 mL/kg體重計算，用灌胃方式將樣品一次給予動物。觀察小鼠的中毒癥狀，死亡只數(shù)，連續(xù)14天，計算半數(shù)致死劑量LD50。

1.2.2.2 家兔多次完整皮膚刺激試驗

取兔子雌雄各兩只，試驗前在實驗室適應3天。提前24 h將背毛剃掉，將凝膠0.5 mL涂于脊柱一側(cè)2.5 cm×2.5 cm范圍的皮膚上，另一側(cè)作空白對照。涂抹4 h后除靜凝膠的殘留。重復涂抹14天，每天1次，觀察結(jié)果。

1.2.2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗

取小鼠雌雄各半，分為樣品1 250 mg/kg、2 500 mg/kg、5 000 mg/kg三個劑量組，以及陽性對照組和陰性對照組。分別稱取1.25 g、2.5 g、5.0 g樣品和40 mg環(huán)磷酰胺，分別加蒸餾水至20 mL混勻后備用，經(jīng)口灌胃。兩次染毒間隔24 h，第二次染毒后6 h處死小鼠，取胸骨髓涂片，姬姆薩應用液染色。每只小鼠在油鏡下選擇細胞著色適當?shù)膮^(qū)域，計數(shù)1 000個嗜多染紅細胞中出現(xiàn)的含有微核的細胞的個數(shù)，計算嗜多染紅細胞與正染紅細胞的比例（PCE/NCE）。

2 結(jié)果與分析

2.1 中和劑鑒定試驗

試驗表明，含0.5%硫代硫酸鈉、0.5%卵磷脂、1.0%甘氨酸、3.0%吐溫-80的PBS溶液可中和該消毒液原有液中含有的殺菌成分，且該中和劑及中和產(chǎn)物對大腸桿菌、白色念珠菌及培養(yǎng)基無明顯影響，詳見表1。

表1 中和劑鑒定結(jié)果

2.2 殺菌試驗結(jié)果

該免洗手消毒凝膠對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌分別作用0.5 min，殺滅對數(shù)值均＞3.0，詳見表2。

2.3 現(xiàn)場試驗結(jié)果

該免洗手消毒凝膠對手作用1.0 min平均殺滅對數(shù)值為1.50，達到消毒合格要求。

2.4 毒性試驗

2.4.1 急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果

小鼠無死亡發(fā)生，該免洗手消毒凝膠對小鼠雌、雄性口服LD50均大于5 000 mg/kg體重，屬于實際無毒，詳見表3。

2.4.2 多次完整皮膚刺激試驗結(jié)果

試驗中有4只兔皮膚出現(xiàn)紅斑等炎性反應，平均每天每只兔刺激反應評分均值為0.89，分級結(jié)果定為輕刺激性，詳見表4。

表2 免洗手消毒凝膠對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的殺滅效果

表3 免洗手消毒凝膠對小鼠急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果

表4 免洗手消毒凝膠對兔多次完整皮膚刺激試驗結(jié)果

2.4.3 小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗結(jié)果

微核率差別無統(tǒng)計學意義，PCE/NCE大于0.1，陽性組顯著高于陰性組。證實該免洗手消毒凝膠對小鼠無染色體損傷作用。詳見表5。

3 討論

本免洗手消毒凝膠對細菌的繁殖體以及真菌均具有很好的殺滅作用，對自然菌也有很好的殺滅作用，作用非常迅速，消毒效果好，達到消毒技術規(guī)范對消毒液消毒效果的要求，毒性屬于實際無毒，輕皮膚刺激性，無染色體損傷作用。

經(jīng)研究，三氯羥基二苯醚和乙醇含量分別為 0.24%、56%[2]，1 100 mg/L、52.8%[3]，1.55%、39.6%[4]，2 690 mg/L、78.7%[5]，12.20 g/L、39.70%[6]，2 690 mg/L、65.0%的手消毒劑[7]，進行載體浸泡定量殺菌試驗，僅0.5 min對各菌就已能達到消毒合格的要求。但含3 750 mg/L三氯羥基二苯醚和體積分數(shù)33%乙醇的消毒液作用0.5 min時對銅綠假單胞菌的平均殺滅對數(shù)值僅達到2.41[8]，作用1 min時方可達到對其消毒合格；也有研究指出，含乙醇75.4%的消毒劑對銅綠假單胞菌的殺滅作用優(yōu)于含0.18%的三氯生[9]；總結(jié)對比可以看出，雖然手消毒液所含三氯羥基二苯醚含量低于1 100 mg/L和乙醇的含量低于33%則會略微影響其進行殺菌的效果和速度，但是，在此含量之上，所含此兩種成分的濃度高低不同并不會影響到消毒液實際的殺菌效果和殺菌速度。

表5 免洗手消毒凝膠對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結(jié)果

乙醇對皮膚有脫脂作用，會讓大部分使用者覺得皮膚干燥，免洗手消毒液做成此研究中使用時感覺濕潤的凝膠狀，會讓使用者更加舒適，人群接受度更高。其與聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽、葡萄糖酸洗必泰、醋酸氯已定、復合碘復配時均出現(xiàn)皮膚發(fā)紅等不良反應的報告[10]，與三氯生復配則不容易出現(xiàn)皮膚過敏[11]。但有報告指出，三氯羥基二苯醚會使水生生物處于有潛在風險的環(huán)境中[12]，可以通過多種途徑進入到環(huán)境介質(zhì)中[13]，而且對生態(tài)環(huán)境、生物發(fā)育也具有潛在的毒性效應[14]，人體還是應避免大劑量的長期重復接觸[15]。本試驗研究結(jié)果也證實此配方對皮膚還是存在有輕度的刺激，且具有刺激性氣味。

綜上所述，建議研發(fā)者在可以在保證殺菌效果的前提下，盡量降低乙醇和三氯羥基二苯醚這兩種主要有效消毒成分的含量，既減小其生產(chǎn)成本、降低對皮膚的刺激程度，使人群接受度更高，又降低對生態(tài)和環(huán)境可能造成的潛在影響和污染；或致力于研發(fā)比以上各配方成分對人體、皮膚刺激性更小，同時對環(huán)境影響也更小的新配方成分。