孫延娜 喬 鐵 張立德

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院，遼寧 沈陽 110847）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，睡眠與中樞神經(jīng)介質(zhì)有關(guān)，氨基酸類遞質(zhì)為神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布的一類遞質(zhì)，包括興奮類神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸（glutamic acid，Glu）、天門冬氨酸（aminosuccinic acid，Asp） 及抑制性神經(jīng)遞質(zhì)甘氨酸（glycine，Gly）、γ-氨基丁酸 （γ-aminobutyric acid，γ-GABA）、牛磺酸 （taurine，Tau） 等［1-3］。目前對鎮(zhèn)靜藥的研究最多的是血清素-羥色胺和GABA能系統(tǒng)。γ-氨基丁酸是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA能通路對于睡眠的影響目前研究比較多，包括Glu及GABA含量及Glu/GABA值，GABA受體及GABA的合成、代謝以及轉(zhuǎn)運(yùn)等。本文從以酸棗仁、五味子、刺五加、龍眼肉、遠(yuǎn)志、茯苓等為主要原料的滋陰養(yǎng)血安神方對PCPA誘導(dǎo)的睡眠剝奪小鼠GABA能通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，探討該中藥方治療失眠的可能機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物及制備 對氯苯丙氨酸（para-chlorophenylalanine，PCPA，Alfa Aesar公司，批號：ZO1B007）；滋陰養(yǎng)血安神方：酸棗仁25 g，五味子5 g，刺五加25 g，龍眼肉25 g，遠(yuǎn)志15 g，茯苓25 g（購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，批號分別為：1711203，1706211，111575，1712261，1802091，1711031） 組成，兌換為小鼠給藥劑量，并摸索劑量設(shè)低、中、高劑量組。常規(guī)方法煎煮制成藥物按1.82 g/mL，3.64 g/mL，7.28 g/mL低、中、高三種濃度，分裝后4℃?zhèn)溆?，灌胃時每只每日給藥0.8 mL/20 g體重；地西泮（山東信誼制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H37023039）；小鼠GABA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(生工生物工程（上海） 股份有限公司，貨號D720127)；小鼠a-Glu酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 (生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號D720330)。

1.2 儀器 多功能酶標(biāo)儀（奧地利MD公司，SpectraMax I3）；雪花制冰機(jī)（上?；蕛x器，F(xiàn)MB50）；基礎(chǔ)電源（美國伯樂公司，1645050）；基礎(chǔ)電泳儀電源（威泰克有限公司，ELITE 300PLUS E5W0541）；高速冷凍離心機(jī)（德國eppendorf 5415C）；分析天平（德國Sartorius BL310/BL21S）；移液器（康寧） （美國corning 4070 4073 4075）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 雄性KM小鼠18～22 g購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供），SPF級，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，所有試驗(yàn)動物相關(guān)的操作均符合國際健康指南。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 KM小鼠48只，購買動物后適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，保持12小時晝夜交替，自由飲水及飲食。隨機(jī)選出8只作為正常對照組，以蒸餾水按1 mL/100 kg灌胃，連續(xù)9 d。其余腹腔注射對氯苯丙氨酸（PCPA）方法復(fù)制失眠小鼠模型，每天上午腹腔注射PCPA300 mg/kg［4］制作實(shí)驗(yàn)性失眠小鼠模型，連續(xù)2 d。其中PCPA用略堿性生理鹽水（PH：7～8），按1 mL/100 g配置成混懸液。模型組第3天以生理鹽水按1 mL/100 g灌胃，連續(xù)7 d。地西泮對照組給予地西泮水溶液灌胃2 mg/kg［5-6］，滋陰養(yǎng)血安神方低劑量組（1.82 g/mL·d）、滋陰養(yǎng)血安神方中劑量組（3.64 g/mL·d）、滋陰養(yǎng)血安神方高劑量組（7.28 g/mL·d） 每天1次，連續(xù)給藥7 d。7 d后，麻醉小鼠迅速冰上取下丘腦，冰浴下沖分勻漿，離心，取上清液，參照ELISA試劑盒說明書處理后，在酶標(biāo)儀450 nm處，檢測小鼠下丘腦組織Glu、GABA含量。

2 結(jié)果

2.1 滋陰養(yǎng)血安神方對PCPA誘導(dǎo)失眠小鼠下丘腦Glu、GABA含量、Glu/GABA比值的影響 利用ELISA法檢測滋陰養(yǎng)血安神方對失眠小鼠下丘腦Glu、GABA含量、Glu/GABA比值的影響，如表1，圖1～2所示：與空白組相比，模型組Glu含量升高（P＜0.05），滋陰養(yǎng)血安神方低、中劑量組與空白組沒有顯著性差異，滋陰養(yǎng)血安神方高劑量組及地西泮組Glu含量降低（P＜0.05）。與模型組相比，滋陰養(yǎng)血安神方低、中、高劑量組及地西泮組均顯著降低了Glu含量（P＜0.05）；與空白組相比，模型組GABA含量明顯升高（P＜0.05），滋陰養(yǎng)血安神方低、中、高劑量組及地西泮組均顯著升高了GABA含量（P＜0.05）。與模型組相比，滋陰養(yǎng)血安神方低、中劑量組與模型組比較沒有顯著性差異，滋陰養(yǎng)血安神方高劑量組及地西泮組均顯著升高了GABA含量（P＜0.05）；與空白組相比，模型組Glu/GABA比值沒有顯著性差異，滋陰養(yǎng)血安神方低、中、高劑量組及地西泮組均顯著降低了Glu/GABA比值（P＜0.05）。與模型組相比，滋陰養(yǎng)血安神方低、中劑量組顯著性降低了Glu/GABA比值（P＜0.05），滋陰養(yǎng)血安神方高劑量組及地西泮組均顯著性降低了 Glu/GABA比值 （P＜0.01）。

表1 各組小鼠下丘腦Glu、GABA含量、Glu/GABA比值比較（，n=8）

表1 各組小鼠下丘腦Glu、GABA含量、Glu/GABA比值比較（，n=8）

組別 鼠數(shù) 劑量 Glu(μmol/g)空白組模型組滋陰養(yǎng)血安神方組（g/kg）地西泮組（mg/kg）8 8 8 8 8 8 73.0 146.0 292.0 1.5 28.49±0.63 29.46±0.45*28.47±0.51＃28.68±0.36＃27.34±0.54*＃27.59±0.41*＃GABA(μmol/g)Glu/GABA 13.57±0.59 14.03±0.63*15.72±0.25*16.39±0.36*16.56±0.54*＃17.24±0.39*2.10±0.12 2.08±0.35 1.81±0.39*＃1.75±0.27*＃1.65±0.16*＃＃1.60±0.21*＃＃

圖1 各組小鼠下丘腦GABA，Glu含量比較

圖2 各組小鼠下丘腦Glu/GABA比值比較

3 討論

失眠與中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸遞質(zhì)及抑制性氨基酸遞質(zhì)的含量及失衡是相關(guān)的，腦干GABA能神經(jīng)元可能控制快速眼動（REM）睡眠，食欲素 (Hcrt)神經(jīng)系統(tǒng)可能是治療失眠的合適治療靶點(diǎn)［7］。目前，很多藥物通過影響GABA能通路影響睡眠。Jo K等［8］進(jìn)行蓮蓬子提取物（NNE）促進(jìn)果蠅睡眠的研究，結(jié)果蓮子水提取物促進(jìn)了睡眠。這種NNE介導(dǎo)的睡眠促進(jìn)效應(yīng)與GABAA/GABAB的上調(diào)有關(guān)。Woo JH等［9］研究發(fā)現(xiàn)紫花前胡醇當(dāng)歸酯能延長戊巴比妥誘導(dǎo)的失眠大鼠睡眠總時間，并增加了GAD65/67和GABA-A受體表達(dá)，通過GABA-A能系統(tǒng)起作用進(jìn)而治療失眠。臨床經(jīng)驗(yàn)方滋陰養(yǎng)血安神方治療失眠，以酸棗仁、五味子、刺五加、龍眼肉、遠(yuǎn)志、茯苓等為主要原料的配方。酸棗仁皂苷A可以調(diào)節(jié)GABA受體的mRNA表達(dá)，通過影響腸黏膜炎癥細(xì)胞因子影響腦中神經(jīng)細(xì)胞之間網(wǎng)絡(luò)而對失眠起鎮(zhèn)定催眠作用，這種機(jī)制與褪黑素類似［10］。

本實(shí)驗(yàn)中，滋陰養(yǎng)血安神方降低了失眠模型組小鼠下丘腦Glu含量，升高了GABA含量，降低了Glu/GABA比值，滋陰養(yǎng)血安神方可能通過對下丘腦Glu、GABA含量、Glu/GABA比值影響失眠小鼠睡眠。滋陰養(yǎng)血安神方能通過GABA能系統(tǒng)通路影響失眠小鼠睡眠。