秦春明

大黃素是大黃、何首烏等常見中藥材中的一個(gè)活性成分，具有良好的抗腫瘤、抗炎和抗微生物等方面作用[1]。因?yàn)榇簏S素具有多種生物活性，同時(shí)在合成的大黃素類似物中也表現(xiàn)出不同的生物活性，特別是在抗腫瘤活性方面有著巨大地開發(fā)潛力[2]。然而，大黃素及其類似物的藥理及分子機(jī)制的研究需深入開展，大黃素及其類似物的藥物靶點(diǎn)特別是基因靶點(diǎn)的作用環(huán)節(jié)十分復(fù)雜，常規(guī)藥理和分子機(jī)制研究方法很難全面揭示抗腫瘤藥理和分子機(jī)制[3]。本研究同時(shí)借助多個(gè)在線數(shù)據(jù)庫資源，分析大黃素及 其類似藥物中已知基因靶點(diǎn)的生物學(xué)信息，借助相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過關(guān)鍵基因通路分析，建立“藥物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步了解大黃素及其類似物抗腫瘤活性、分子機(jī)制提供資料和思路。

1 資料與方法

1.1 大黃素類似物篩選

藥物數(shù)據(jù)DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）是世界最大、最完整的藥物資源庫，由加拿大衛(wèi)生研究院提供支持。通過檢索全醫(yī)藥學(xué)大詞典，獲取 大黃素化學(xué)名稱列表，將該列表導(dǎo)入DrugBank 數(shù)據(jù)庫中在線檢索，基于化合物結(jié)構(gòu)相似、生物活性相近的原則，以相似度評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)篩選藥物，以系統(tǒng)默認(rèn)的相似度評(píng)分閾值＞0.7 為標(biāo)準(zhǔn)[4]，獲取高相似度藥物的編號(hào)及藥物名稱。

1.2 基因靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

生物醫(yī)學(xué)文本挖掘的一個(gè)關(guān)鍵任務(wù)是發(fā)現(xiàn)各種生物醫(yī)學(xué)實(shí)體之間的潛在關(guān)聯(lián)，Polysearch 2.0（http： //polysearch.cs.ualberta.ca/）是一個(gè)在線文本挖掘系統(tǒng)，可以用于識(shí)別人類疾病、基因、蛋白質(zhì)、藥物等之間關(guān)系的生物數(shù)據(jù)庫。將大黃素及其類似物列表，通過Polysearch 2.0 數(shù)據(jù)庫檢索，獲取大黃素及其類似物已知靶點(diǎn)列表，該列表導(dǎo)入可視化軟件Cytoscape 3.6.1，將結(jié)果可視化輸出，大黃素及其類似物和靶點(diǎn)由節(jié)點(diǎn)表示，2 個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的相互作用由邊表示。節(jié)點(diǎn)的度數(shù)是與節(jié)點(diǎn)相連邊的數(shù)量，度數(shù)越大，說明網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)直接相關(guān)的節(jié)點(diǎn)數(shù)越多，表明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析

String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）主要是一個(gè)搜尋蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫，是一個(gè)檢索相互作用基因的搜索工具，可以用于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用信息的生物數(shù)據(jù)庫。將上述所得基因信息導(dǎo)入到String 數(shù)據(jù)庫中，將置信度評(píng)分≥0.7 定義為顯著，通過可視化工具Cytoscape 3.6.1 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，以閾值degree＞10 為標(biāo)準(zhǔn)確定中心基因。使用Cytoscape插件MCODE（Molecular Complex Detection,MCODE）對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)的模塊進(jìn)行分析，篩選顯著模塊，條件設(shè)置為：degree cutoff=2，node score cutoff=0.2，k-core=2，maximum depth=100[5]。

1.4 KEGG 通路分析

生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）可以提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，能夠找出最顯著富集的生物學(xué)注釋，通過David 數(shù)據(jù)庫對(duì)上述顯著模塊中基因KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析，設(shè)定閾值P＜0.05，篩選具有顯著性差異的生物學(xué)過程和通路[5]。

2 結(jié)果

2.1 大黃素類似物篩選結(jié)果

通過DrugBank 數(shù)據(jù)庫篩選，以大黃素相似度評(píng)分為1，相似度評(píng)分＞0.7 的共找到7 個(gè)，根據(jù)相似度評(píng)分對(duì)大黃素類似物行降序排列，有1,2,5,8-四羥基蒽醌-9,10-二酮（1,2,5,8-tetrahydroxy anthracene- 9,10-dione）、二羥蒽醌（Dantron）、大黃酸（Rhein）、大黃酸蒽酮（Rheinanthrone）、蒽啉（Anthralin）、氧化乙?；烊樱∣xidized Acetyl Dithranol）、乙?；烊樱ˋcetyl Dithranol）共7 個(gè)。

2.2 大黃素及7 個(gè)類似物潛在的基因靶點(diǎn)

通過Polysearch 2.0 數(shù)據(jù)庫檢索，收集大黃素及7 個(gè)類似物潛在的相關(guān)基因靶點(diǎn)，其中大黃素有36 個(gè)基因靶點(diǎn)，大黃酸有30 個(gè)基因靶點(diǎn)，蒽啉有3 個(gè)靶點(diǎn)，二羥蒽醌有1 個(gè)基因靶點(diǎn)，其余化合物在Polysearch 2.0 數(shù)據(jù)庫均未檢索到相關(guān)基因靶點(diǎn)。通過資料匯總，剔除重復(fù)基因靶點(diǎn)，共收集到60 個(gè)基因靶點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建化合物-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示（方形節(jié)點(diǎn)為藥物，橢圓形節(jié)點(diǎn)為基因靶點(diǎn)）。圖中共64 個(gè)節(jié)點(diǎn)（4 個(gè)大黃素及其類似物和60 個(gè)潛在基因靶點(diǎn)），其中大黃素與大黃酸溝通作用基因靶點(diǎn)有7 個(gè)，大黃素與蒽啉溝通作用基因靶點(diǎn)有2 個(gè)，BARS 基因則是大黃素、大黃酸、大黃酸蒽酮共同作用的靶點(diǎn)。

2.3 基因靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

基因靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)由String 數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建的60 個(gè)節(jié)點(diǎn)和168 條邊組成，PPI 富集P=1.0E-16。將String 數(shù)據(jù)庫中所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件進(jìn)行可視化（圖2A），以閾值degree＞10 為標(biāo)準(zhǔn)，確定的中心基因總共13 個(gè)，分別有VEGFA、BCL2、IL8、IL1B、CXCL12、PTGS2、HRAS、CDH1、FGF2、TLR4、HSPA4、VIM、KIT。通過Cytoscape 3.6.1軟件插件MCODE 在構(gòu)建的PPI 圖中篩選出顯著模塊，顯著模塊中有13 個(gè)節(jié)點(diǎn)和70 條邊組成，且篩選出模塊中包含所有中心基因（圖2B）。

2.4 KEGG 通路富集分析

與相關(guān)的13 個(gè)基因靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路注釋，得到P＜0.05 的通路有24 條，根據(jù)P值大小排序列出前5 的KEGG 通路（表1）主要涉及腫瘤過程、NF-kappa B 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、miRNA腫瘤過程和Rap1 信號(hào)通路，涉及基因包括HRAS、PTGS2、BCL2、VEGFA、CDH1、KIT、FGF2、CXCL12、IL1B、TLR4、KIT、FGF2 等，其中NF-B 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路和Rap1 信號(hào)通路均與腫瘤關(guān)系密切。

圖1 藥物-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（A 為PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，B 為顯著表達(dá)基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖）

表1 Top 5 KEGG 通路富集分析

3 討論

大黃素是中藥中重要的單體化合物，具有多種功效，包括抗炎、抗腫瘤和抗微生物、保護(hù)肝腎、改善微循環(huán)等作用，其衍生物也報(bào)道均有多種生物活性，包括抗腫瘤生物活性[6]。多數(shù)研究是基于傳統(tǒng)的藥理學(xué)方法，對(duì)于傳統(tǒng)藥理學(xué)方法揭示藥物的藥理作用機(jī)制有較完善和成熟的研究思路和方法，但是，這些研究方法很難全面描述藥物與機(jī)體直接錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系及分子機(jī)制，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，系統(tǒng)闡述了機(jī)體與藥物相互作用的原理與規(guī)律[7]。

本研究通過已有的數(shù)據(jù)庫資源（DrugBank、Polysearch 2.0、String、DAVID），運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對(duì)大黃素及其類似物整理分析已知基因靶點(diǎn)信息，構(gòu)建了藥物-基因靶點(diǎn)效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)圖，同時(shí)通過運(yùn)用PPI 網(wǎng)絡(luò)找尋網(wǎng)絡(luò)中的顯著基因，獲得了大黃素及其類似物所對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，通過富集分析，獲取基因所涉及通路。研究結(jié)果顯示，大黃素類似物具有潛在的抗腫瘤活性，有可能通過影響NF-κB 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路和Rap1信號(hào)通路而發(fā)揮抗腫瘤活性。

大黃素及其類似物通過多靶點(diǎn)和多種通路協(xié)調(diào)發(fā)揮抗腫瘤作用。大黃素及其類似物涉及與抗腫瘤密切相關(guān)的生物學(xué)過程有細(xì)胞分裂，涉及基因包括VEGFA、CXCL12 等多種基因，Lin 等[8]研究報(bào)道大黃素具有抑制細(xì)胞的分裂增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)通過調(diào)節(jié)VEGFR 等發(fā)揮抑制血管生成的作用，具有雙重抗腫瘤作用。大黃素也可以下調(diào)肝癌細(xì)胞中CXCL12-CXCR4 信號(hào)，CXCL12-CXCR4 信號(hào)級(jí)聯(lián)在肝癌患者侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，抑制CXCL12 誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞系遷移和侵襲[9]。

本研究中通過KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，大黃素及其類似物涉及NF-κB 通路、PI3K/Akt 信號(hào)通路等。NF-κB 通路在體內(nèi)是一條經(jīng)典的通路，NF-κB 信號(hào)的失調(diào)與腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病密切相關(guān)[10]，在肺癌細(xì)胞中，大黃素通過對(duì)TRIB3 的下調(diào)，通過NF-κB 信號(hào)通路，影響誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而抑制肺癌生長(zhǎng)[11]。PI3K/Akt 信號(hào)通路是絡(luò)氨酸激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)通路，與腫瘤增殖、生長(zhǎng)、凋亡、參與血管生成等密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等過程中具有重要作用[12]；PI3K/Akt 信號(hào)通路異?；罨?，磷酸化酶激酶-3β，進(jìn)而降低抗凋亡蛋白BCL2的降解，從而抑制凋亡，大黃素可誘導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和p38 的磷酸化，同時(shí)輕度抑制p-c-Jun-n 端激酶（p-JNK）的表達(dá)，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。

總之，本研究通過大黃素類似物篩選、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、KEGG 通路分析對(duì)大黃素一類藥物的抗腫瘤潛在作用機(jī)制進(jìn)行探討，為了解抗腫瘤機(jī)制提供了理論依據(jù)，為今后研究這一類藥物的共同作用機(jī)制提供依據(jù)。