趙 亮 李霞飛 李成成 閆歡歡 張其清*

1(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，生命科學(xué)與健康研究院，河南 新鄉(xiāng) 453003)2(北京大學(xué)香港科技大學(xué)深圳研修院，廣東 深圳 518057)3(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

引言

目前在冠心病治療中，支架介入手術(shù)是主要的使用手段，但多支冠狀動(dòng)脈的彌漫性狹窄仍需要進(jìn)行搭橋手術(shù)，其金標(biāo)準(zhǔn)仍然是冠狀動(dòng)脈旁路移植(coronary artery bypass grafting，CABG)。每年全世界有80萬(wàn)例患者需行CABG手術(shù)，主要依賴(lài)于可用的自體健康血管。然而，自體血管有限而存在局限性，且自體移植易造成二次傷害。研究發(fā)現(xiàn)，脫細(xì)胞血管支架是極佳的血管移植材料，通過(guò)人工脫細(xì)胞處理的天然血管支架的細(xì)胞外基質(zhì)完整，可以提供給細(xì)胞正常的吸附、增殖、分裂等環(huán)境，理化性質(zhì)和天然的血管結(jié)構(gòu)相似，但是在血液相容性及抗血栓形成上仍然具存在很大的不足[1-3]。

理想的組織工程脫細(xì)胞血管支架應(yīng)該完全移除所含的細(xì)胞成分，最大化地保留彈性纖維和膠原纖維，最大程度地降低生物材料的免疫原性，更好地保留三維微環(huán)境，從而提供給細(xì)胞更加良好的生長(zhǎng)環(huán)境，進(jìn)而更好地避免人們?cè)谘苤脫Q后脫細(xì)胞血管支架的鈣化和腐敗，提高脫細(xì)胞血管支架的耐用性[4]。伴隨著組織工程脫細(xì)胞血管支架的深入研究，人們更加追求優(yōu)秀的、免疫原性低的、更符合組織工程脫細(xì)胞血管支架要求的生物材料的制備方法。有資料顯示，僅采用的酶或/和去垢劑制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)，仍存在誘發(fā)血栓形成、力學(xué)機(jī)械性能不足和移植產(chǎn)生免疫反應(yīng)等方面的問(wèn)題。在筆者的實(shí)驗(yàn)中，脫細(xì)胞支架經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的Triton-x100處理后再由丹參酚酸B后處理，通過(guò)對(duì)兩種方法制備的脫細(xì)胞血管支架的親水性、體外溶血率、鈣化和凝固時(shí)間、動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間及血小板的黏附情況等數(shù)據(jù)的測(cè)定與對(duì)比分析，探究經(jīng)Triton-x100加丹參酚酸B處理后制備的組織工程脫細(xì)胞血管支架的血液相容性能的變化，為其在臨床上心血管和腦血管疾病治療的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。選擇SD大鼠16只，雄性，鼠齡7周，體質(zhì)量250 g左右；購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(豫)2017-0001，置于生科院動(dòng)物房普通飼養(yǎng)。

2)主要試劑。磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)、Triton-x100(北京索萊寶生物科技有限公司)，脫氧膽酸鈉、DNA酶、RNA酶、丹參酚酸B(合肥博美生物科技有限公司)，乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)(天津東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠)，CaCl2、戊二醛、無(wú)水乙醇(天津德恩化學(xué)試劑有限公司)，Hank′s溶液(Sigma公司，美國(guó))，肝素鈉(Hyclone，美國(guó))。

3)儀器。電子分析天平(梅特勒-托力多儀器(上海)有限公司)，常溫高速離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，37℃恒溫水浴箱(北京光明醫(yī)療儀器有限公司)，UV-1100型紫外線可見(jiàn)光分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher公司)，電子顯微鏡(日立高新技術(shù)有限公司)，冰箱(河南新飛電器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1配制脫細(xì)胞液

血管脫細(xì)胞溶液由脫氧膽酸鈉(含量為0.25%)、Triton-x100(含量為0.25%)、DNA酶(含量為0.02%)、RNA酶(含量為0.02%)和EDTA(含量為0.02%)的溶液配比而成[5]。脫細(xì)胞培養(yǎng)溶液用量為50 mL，故采用容量50 mL燒杯進(jìn)行配置。用電子分析天平稱(chēng)取0.125 g脫氧膽酸鈉、0.01 g DNA酶、0.01 g RNA酶，用移液槍吸取0.125 mL Triton-x100溶液、0.01 mL EDTA溶液，置于上述燒杯中待用。最后在燒杯中加入蒸餾水，將溶液定容至50 mL后，再將所有的試劑充分?jǐn)嚢杌靹颍门Ｆぜ埫芊獗４嬗?℃冰箱備用。

1.2.2制備脫細(xì)胞血管支架

1)SD大鼠腹主動(dòng)脈的獲取。將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為2組，每組8只。解剖SD大鼠獲得腹主動(dòng)脈[6]。兩組名稱(chēng)分別標(biāo)記為T(mén)riton-x100組(Tx組)和Triton-x100-丹參酚酸B組(Tx-sal 組)。

2)Tx組處理方法。參照文獻(xiàn)[7]的方法。將Tx組的SD大鼠腹主動(dòng)脈用75%乙醇溶液反復(fù)消毒處理4～6次，再用PBS沖洗3次以上，直至溶液澄澈；將處理好的脫細(xì)胞血管支架置于25 mL配備好的脫細(xì)胞培養(yǎng)溶液中，在37℃恒溫下、100 r/min的搖床上脫細(xì)胞處理48 h；取出，再用PBS反復(fù)沖洗3～5次，直至溶液澄澈；取10 mL離心管，加入8 mL Hank′s溶液，將PBS沖洗好的脫細(xì)胞血管支架轉(zhuǎn)移至該離心管中，放置于4℃冰箱保存。

3)Tx-sal 組處理方法。參照文獻(xiàn)[8]的方法。將Tx-sal 組SD大鼠腹主動(dòng)脈用75%乙醇溶液反復(fù)消毒處理4～6次，再用PBS沖洗3次以上，直至溶液澄澈；將處理好的脫細(xì)胞血管支架置于25 mL配備好的脫細(xì)胞培養(yǎng)溶液中，在37℃恒溫下、100 r/min的搖床上脫細(xì)胞處理48 h；取出，再用PBS反復(fù)沖洗3～5次，直至溶液澄澈；接著轉(zhuǎn)移至含有8 mL 0.5%丹參酚酸B溶液的10 mL離心管中，在37℃恒溫下、100 r/min的搖床上繼續(xù)培養(yǎng)48 h；然后取出培養(yǎng)好的脫細(xì)胞血管支架，用PBS反復(fù)沖洗澄澈后，置于Hank′s液中放4℃冰箱中保存。

1.2.3親水性測(cè)試

在Tx組、Tx-sal 組試管中各取出1枚脫細(xì)胞血管支架，用縱切法切開(kāi)。將2組支架用PBS清洗并用氮?dú)獯蹈?，然后采用自?dòng)接觸角儀進(jìn)行水接觸角測(cè)試，觀察支架親水性。實(shí)驗(yàn)設(shè)置5組平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算結(jié)果取平均值。

1.2.4體外溶血實(shí)驗(yàn)

制備抗凝血：從SD大鼠心臟取血80 mL，加入8 mL肝素鈉，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠹礊橹苽涞目鼓胖糜?℃的冰箱冷藏保存[9]。

脫細(xì)胞血管支架體外溶血率測(cè)定：分別向6支試管中加入5 mL 0.9%的氯化鈉溶液，然后從Tx組和Tx-sal 組脫細(xì)胞血管支架中各取3個(gè)，分別置入各試管中。將6支試管轉(zhuǎn)移至恒溫37℃水浴箱，水浴30 min。取抗凝血2 mL，用2.5 mL 0.9%的氯化鈉溶液稀釋備用。取出水浴中的2組試管，分別加入稀釋后的抗凝血0.1 mL，然后繼續(xù)在37℃水浴箱中水浴60 min。將水浴好的2組試管中的溶液轉(zhuǎn)移至10 mL的離心管中，在溫度27℃、離心半徑13.5 cm、離心速度2 000 r/min的條件下離心5 min[10]。離心結(jié)束后取出離心管，小心將離心好的溶液上清液用移液槍吸取置于比色皿中，用UV-1100型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，測(cè)量其在545 nm波長(zhǎng)下的光密度，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并制成表格比較。

1)陽(yáng)性對(duì)照組[11]。將清洗干凈并烘干的3支試管標(biāo)記為陽(yáng)性組，分別加入5 mL蒸餾水。打開(kāi)水浴鍋調(diào)節(jié)溫度為37℃，待溫度穩(wěn)定后將3支試管放入水浴箱中，再分別在3支水浴好的試管中加入配備的稀釋血液0.1 mL，繼續(xù)恒溫水浴60 min。然后，在離心半徑13.5 cm、離心速度2 000 r/min的條件下離心5 min。等到離心結(jié)束，離心機(jī)停止，取出離心管，小心用移液槍吸取上清液置于比色皿中，切勿將底物沉淀混入到上清液中，測(cè)量上清液在545 nm波長(zhǎng)處的光密度并記錄。

2)陰性對(duì)照組。將清洗干凈并烘干的3支試管標(biāo)記為陰性對(duì)照組，并分別加入5 mL 0.9%氯化鈉溶液。打開(kāi)水浴鍋調(diào)節(jié)溫度為37℃，待溫度穩(wěn)定后將3支試管放入水浴箱中，再分別在3支水浴好的試管中加入配備的稀釋血液0.1 mL，繼續(xù)恒溫水浴60 min。然后，在離心半徑13.5 cm、離心速度2 000 r/min的條件下離心5 min。用移液槍取出離心后的上清液，置于比色皿中，切勿將底物沉淀混入上清液中，測(cè)量上清液在545 nm波長(zhǎng)處的光密度并記錄。

溶血率計(jì)算公式如下：

(1)

1.2.5復(fù)鈣化凝血時(shí)間測(cè)定

取2組脫細(xì)胞血管支架各3枚，置于6個(gè)培養(yǎng)皿中，分別加入5 mL PBS。浸泡24 h后，用移液槍取用抗凝血1.5 mL于離心管中，在37℃、2 000 r/min的離心機(jī)條件下離心20 min。取其血漿轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL的離心管中，放置于37℃恒溫水浴箱待用。將200 μL預(yù)熱好的血漿分別加入到6組培養(yǎng)皿中混合均勻，并將培養(yǎng)皿置于37℃恒溫水浴箱中水浴10 min；然后加入0.2 mL CaCl2溶液于培養(yǎng)皿中，開(kāi)始計(jì)時(shí)，肉眼觀察在6個(gè)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)第一條白色纖維時(shí)停止計(jì)時(shí)[12]；記錄6個(gè)培養(yǎng)皿出現(xiàn)白色纖維的時(shí)間，并計(jì)算Tx組、Tx-sal B組的平均值。

1.2.6動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間測(cè)定

取制備2組脫細(xì)胞血管支架各3枚，置于6個(gè)錐形瓶中，分別加入5 mL Hank′s溶液于6個(gè)錐形瓶中，在37℃水浴箱中水浴15 min。然后，取出脫細(xì)胞血管支架置于培養(yǎng)皿中，并做好標(biāo)記。分別加入抗凝血2 mL，在37℃水浴鍋中恒溫5 min后，再向6個(gè)培養(yǎng)皿中分別滴加0.2 mL CaCl2溶液，持續(xù)振蕩1 min，使CaCl2與抗凝血均勻混合。將混勻的培養(yǎng)皿放置于37℃水浴箱中恒溫處理，并用秒表計(jì)時(shí)，分別在10、20、30、40、50 min時(shí)，取出一個(gè)0.2 mL樣品加50 mL蒸餾水稀釋[13]，持續(xù)手動(dòng)振蕩10 min，放置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上靜置沉淀。再將靜置后的樣品取上清液，在UV-1100型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)上測(cè)定其在540 nm處的光密度，并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

蒸餾水組：將抗凝血取用2 mL滴加到50 mL蒸餾水中作為T(mén)x組，手動(dòng)搖晃10 min后，靜置至溶液上層澄澈，取上清液。在分光光度計(jì)下，測(cè)量在540 nm處的光密度。

抗凝血率計(jì)算公式如下：

(2)

式中，Is為抗凝血與樣品、CaCl2溶液接觸一定時(shí)間抗凝血的相對(duì)光密度，Iw為蒸餾水混合抗凝血后的相對(duì)光密度。

1.2.7血小板黏附實(shí)驗(yàn)

取出抗凝血2 mL，將其轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，在37℃、2 000 r/min條件下離心20 min；取上清液，即為抗凝血血漿。將上清液血漿取出倒入1.5 mL離心管中，在37℃恒溫水浴箱中預(yù)熱10 min；然后取出2組脫細(xì)胞血管支架，分別裁剪為約0.5 cm×0.5 cm的膜，各5張膜；經(jīng)PBS浸泡24 h后，將其表面向上置于24板孔中，記錄Tx組、Tx-sal 組。在有膜的孔中分別滴加0.6 mL預(yù)熱后的血漿，在37℃的水浴箱中恒溫水浴2 h，取出后經(jīng)過(guò)PBS反復(fù)沖洗3～5次；至溶液清澈后，將膜放置于24孔板上，經(jīng)過(guò)2.5%戊二醛固定液固定后，再用無(wú)水乙醇溶液經(jīng)梯度法脫水，放置于實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)處自然干燥，膜噴金后在電子顯微鏡下觀察兩組脫細(xì)胞血管支架膜上黏附的血小板數(shù)量及集聚情況。

1.2.8補(bǔ)體激活實(shí)驗(yàn)

取制備好的脫細(xì)胞血管支架，在2組脫細(xì)胞血管支架中各取出1枚，用PBS反復(fù)沖洗至溶液澄澈。然后將2枚脫細(xì)胞血管支架裁剪為0.5 cm×0.5 cm大小的膜，再用細(xì)胞培養(yǎng)板的1個(gè)小孔盛取1 mL制備好的SD大鼠的血漿，將裁剪好的膜置于盛有血漿的細(xì)胞培養(yǎng)板孔中。另外，在另外1個(gè)小孔中盛1 mL血漿，設(shè)置為空白組。實(shí)驗(yàn)共采用10個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，即Tx組占據(jù)10孔，Tx-sal 組占據(jù)10孔，空白組占據(jù)10孔。配置完整后打開(kāi)CO2培養(yǎng)箱，將培養(yǎng)條件設(shè)置為37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2，培養(yǎng)30 min。待培養(yǎng)結(jié)束后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，采用放射免疫鑒定法測(cè)定血漿中補(bǔ)體C3a des Arg的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脫細(xì)胞血管支架的宏觀形貌

血管支架經(jīng)脫細(xì)胞處理后，Tx組脫細(xì)胞血管支架表面呈透明色，Tx-sal 組脫細(xì)胞血管支架表面呈白色透明狀；兩組脫細(xì)胞血管的血管壁完整，而新鮮的血管呈紅色，與處理后的脫細(xì)胞血管支架材質(zhì)相比，除顏色外并無(wú)明顯差異。

2.2 脫細(xì)胞血管支架的親水性

Tx組接觸角為76.36°±4.65°，Tx-sal 組接觸角為71.26 °±3.55°，前者略高于后者，差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖1)。

圖1 脫細(xì)胞血管支架的親水性Fig.1 Hydrophilic properties of acellular vascular scaffold

表1 體外溶血實(shí)驗(yàn)各組光密度和溶血率

2.3 體外溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

陽(yáng)性組加入蒸餾水離心后，上清液呈紅色，下層沉淀也為紅色。陰性組在加入氯化鈉溶液離心后，上清液幾乎呈無(wú)色，沒(méi)有發(fā)生溶血。Tx組溶血率為2.1%，Tx-sal 組溶血率為1.5%，見(jiàn)表1。依據(jù)國(guó)家限定的生物材料溶血率(小于5%)，Tx-sal 組和Tx組數(shù)據(jù)都符合國(guó)內(nèi)對(duì)于組織工程血管材料制品溶血率的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 復(fù)鈣化凝血時(shí)間測(cè)定結(jié)果

Tx組復(fù)鈣化凝血時(shí)間為(212±11.32)s，Tx-sal 組復(fù)鈣化凝血時(shí)間為(231±13.53)s；Tx組與Tx-sal 組的復(fù)鈣化凝血時(shí)間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.64，P=0.03)(見(jiàn)圖2)。Tx-sal 組相比Tx組復(fù)鈣化凝血時(shí)間長(zhǎng)，表明應(yīng)用Triton-x100與丹參酚酸B處理的脫細(xì)胞血管支架的抗凝血性能優(yōu)于單一經(jīng)Triton-x100處理的脫細(xì)胞血管支架。

2.5 動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間結(jié)果

在蒸餾水組，血液在蒸餾水的作用下發(fā)生了大范圍的溶血。Tx-sal組、Tx組隨時(shí)間延長(zhǎng)，BCI逐漸下降；但是Tx-sal組比Tx組的BCI略高，即要達(dá)到相同的凝血情況，Tx-sal組要經(jīng)歷更長(zhǎng)的時(shí)間，說(shuō)明Tx-sal組相比Tx組延緩了凝血時(shí)間，抗凝血性更加優(yōu)良(見(jiàn)圖3)。

2.6 體外血小板黏附情況

經(jīng)電子顯微鏡觀察，在每個(gè)照片上，Tx組脫細(xì)胞血管支架膜上黏附血小板的平均數(shù)量為36.2±2.3個(gè)，Tx-sal組血小板的平均黏附數(shù)量為29.3±1.1個(gè)；兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.69，P=0.01)。Tx-sal組血小板黏附數(shù)量小于Tx組的數(shù)量，說(shuō)明應(yīng)用Triton-x100與丹參酚酸B處理的脫細(xì)胞血管支架，比只經(jīng)過(guò)Triton-x100處理的脫細(xì)胞血管支架具有更加優(yōu)良的抗血栓性(見(jiàn)圖4)。

圖2 復(fù)鈣化凝血時(shí)間Fig.2 Cylindrical diagram of recalcification clotting time

圖3 動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間BCI曲線Fig.3 BCI curve of dynamic coagulation time

圖4 血小板黏附數(shù)量Fig.4 Platelet adhesion number

2.7 補(bǔ)體激活實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過(guò)放射免疫測(cè)定法檢測(cè)，Tx組補(bǔ)體水平為(0.98±0.07)μg/mL，Tx-sal 組補(bǔ)體水平為(0.700±0.080)μg/mL，前者略高于后者組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)。

3 討論

為了保證脫細(xì)胞血管支架具有良好的療效、更加穩(wěn)定的治療安全性，在治療方面所采用的組織工程血管材料在生物相容性方面不能有絲毫的疏忽。在臨床應(yīng)用前，生物材料一般應(yīng)通過(guò)體外血液相容性以及生物相容性的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)，所以更多地會(huì)選擇對(duì)脫細(xì)胞血管支架的親水性、溶血率、凝血時(shí)間及血小板黏附情況、補(bǔ)體激活等進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

脫細(xì)胞血管支架材料不但除去了血管原有的間質(zhì)細(xì)胞和DNA 等具有免疫原性的物質(zhì)，保留了血管的原有形態(tài)結(jié)構(gòu)及物理性能，而且保存了富含生長(zhǎng)因子及細(xì)胞黏附信號(hào)的細(xì)胞識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)，易于種植內(nèi)皮細(xì)胞，并且能有效避免血栓形成，具有十分良好的生物相容性，能夠滿足血管移植等方面的要求，是較為理想的血管組織工程、血管支架移植材料。但是，在脫細(xì)胞處理過(guò)程中，也出現(xiàn)了鈣化、生物力學(xué)性能和血液相容性等降低的現(xiàn)象。Triton x-100是一種非離子型表面活性劑，可以通過(guò)其分子上的親水基團(tuán)溶解細(xì)胞而達(dá)到清除血管壁細(xì)胞成分的目的。有研究發(fā)現(xiàn)，使用Triton x-100和膽鹽處理瓣膜組織，并不影響膠原和彈力纖維的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。丹參酚酸B為一種縮酚酸多羥基化合物，對(duì)心臟和血管性疾病還具有防治作用，如可以防治動(dòng)脈粥樣硬化。丹參酚酸B能夠改善膠原纖維，使脫細(xì)胞處理之后不穩(wěn)定的膠原纖維變得更加穩(wěn)定，從而使脫細(xì)胞血管壁改性。筆者實(shí)驗(yàn)采用兩種方法：一種是傳統(tǒng)的Triton-x100法，一種是應(yīng)用Triton-x100與丹參酚酸B處理SD大鼠腹主動(dòng)脈脫細(xì)胞血管支架。比較兩種不同方法處理脫細(xì)胞血管支架的血液相容性，展望生物材料脫細(xì)胞血管支架在治療心血管和腦血管疾病方面的應(yīng)用前景。通過(guò)比較兩組脫細(xì)胞血管支架的生物形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特征及血液相容性，比較它們的優(yōu)缺點(diǎn)，從而對(duì)在臨床應(yīng)用上的特殊情況區(qū)別對(duì)待[15]。

筆者從實(shí)驗(yàn)觀察，除顏色外，脫細(xì)胞血管支架的宏觀形貌上與正常血管并無(wú)明顯差異，形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然血管相似，其中Tx組脫細(xì)胞血管支架呈現(xiàn)透明狀態(tài)，Tx-sal 組脫細(xì)胞血管支架呈現(xiàn)乳白透明狀。在對(duì)兩組脫細(xì)胞血管支架進(jìn)行的體外溶血實(shí)驗(yàn)測(cè)定溶血率的過(guò)程中，陽(yáng)性組經(jīng)離心后溶液呈紅色，用分光光度計(jì)測(cè)量光密度后溶血率為100%；而陰性對(duì)照組經(jīng)離心后上清液都呈現(xiàn)無(wú)色透明，底部有些許紅色沉淀。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得出，Tx-sal組的溶血率為1.5%，Tx組的溶血率為2.1%，均符合國(guó)家對(duì)生物制備的材料在臨床上溶血率小于5%的要求。應(yīng)用Triton-x100和丹參酚酸B處理后的脫細(xì)胞血管支架，比傳統(tǒng)的Triton-x100法具有更加優(yōu)良的抗凝血性和更低的毒性，與其他學(xué)者研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相仿[16]。在脫細(xì)胞血管的親水性方面，通過(guò)對(duì)接觸角的測(cè)量，Tx-sal 組相比Tx組接觸角降低，說(shuō)明經(jīng)Triton-x100和丹參酚酸B處理后脫細(xì)胞血管支架在親水性方面更加優(yōu)良，能夠有效地減少黏附的血小板數(shù)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。在復(fù)鈣化凝血實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)兩組脫細(xì)胞血管支架上滴加抗凝血后又加入Ca2+，這是為了檢測(cè)內(nèi)源凝血系統(tǒng)。通過(guò)肉眼觀察，Tx-sal 組脫細(xì)胞血管支架血液中出現(xiàn)纖維蛋白較晚，證明丹參酚酸B可以提高脫細(xì)胞血管支架的血液相容性。在兩組脫細(xì)胞血管支架的動(dòng)態(tài)凝血實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)Tx-sal 組脫細(xì)胞血管支架曲線略高于Tx組脫細(xì)胞血管支架曲線，說(shuō)明經(jīng)Triton-x100和丹參酚酸B處理后脫細(xì)胞血管支架的抗凝血性能優(yōu)于單獨(dú)Triton-x100處理的脫細(xì)胞血管支架，兩條曲線隨著時(shí)間逐漸下降，BCI逐漸降低，證明了CaCl2中Ca2+使抗凝血恢復(fù)了血液凝集性。通過(guò)血小板體外黏附實(shí)驗(yàn)，比較Tx-sal 組與Tx組血管膜上血小板的黏附數(shù)量和黏附密集程度，可以證明脫細(xì)胞血管膜不會(huì)引起血栓的形成，而Tx-sal 組膜上黏附血小板數(shù)量小于Tx組的數(shù)量；說(shuō)明在經(jīng)過(guò)Triton-x100和丹參酚酸B雙重處理后，脫細(xì)胞血管支架的抗血栓性能要優(yōu)于Triton-x100單獨(dú)處理的脫細(xì)胞血管支架的抗血栓性能。也有學(xué)者采用去污劑-酶消化法制備犬頸動(dòng)脈脫細(xì)胞支架,將肝素分子交聯(lián)至支架表面，并將制備的肝素固化血管和脫細(xì)胞血管基質(zhì)植入犬頸動(dòng)脈進(jìn)行異體血管移植實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)肝素固化后具有良好的抗凝血性能,植入異體犬頸動(dòng)脈1個(gè)月后，肝素固化組移植血管均維持通暢，植入單純脫細(xì)胞血管基質(zhì)者因血栓形成而閉塞。在補(bǔ)體激活實(shí)驗(yàn)中，Tx組補(bǔ)體激活水平略高于Tx-sal組的水平，這表明在血液相容性方面，經(jīng)過(guò)Triton-x100和丹參酚酸B雙重處理后的脫細(xì)胞血管支架的性能更加優(yōu)良。

經(jīng)過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)可以看出，人工脫細(xì)胞處理的天然血管依然具有原有的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特征，可以供給細(xì)胞黏附、增殖。用Triton-x100處理后再經(jīng)過(guò)丹參酚酸B處理的脫細(xì)胞血管支架在血液相容性方面更加優(yōu)良，在臨床心血管和腦血管疾病治療方面具有一定的實(shí)施空間。但筆者所有的實(shí)驗(yàn)環(huán)境都為體外，具體應(yīng)用到動(dòng)物體或人體的數(shù)據(jù)尚待測(cè)量；關(guān)于Triton-x100和丹參酚酸B處理制備的脫細(xì)胞血管支架在動(dòng)物體或者人體的臨床應(yīng)用，還需在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步測(cè)定與分析。

4 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)的Triton-x100法和應(yīng)用Triton-x100與丹參酚酸B處理的兩種方法，成功制備了SD大鼠腹主動(dòng)脈脫細(xì)胞血管支架，完成了對(duì)這兩種支架的形態(tài)學(xué)觀察和血液相容性實(shí)驗(yàn)。研究證明，應(yīng)用Triton-x100與丹參酚酸B處理的脫細(xì)胞血管支架的血液相容性要優(yōu)于單一的經(jīng)過(guò)Triton-x100處理的脫細(xì)胞血管支架的血液相容性。