楊 洋， 李 覺

(同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092)

心肌肥大是心臟對多種心血管刺激，如激素、細胞因子和外界壓力等因素的刺激下的一種適應(yīng)性反應(yīng)，持續(xù)性的心肌肥大會造成心臟的失代償，并進一步發(fā)展為心肌缺血、心律失常和心力衰竭，甚至猝死，心肌肥大是心血管疾病發(fā)病率和死亡率增高的主要原因之一[1]。因此，探討心肌肥大的發(fā)病機制，尋求有效的防治措施具有重要意義。研究[2]表明，心肌肥大主要與細胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路激活密切相關(guān)。綠原酸(CGA)類物質(zhì)是植物體內(nèi)有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙酸類次生代謝產(chǎn)物[3]，是咖啡酸與奎尼酸形成的縮酚酸[4]，具有較強的生物活性,具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降糖等多種作用[5]。CGA在異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的心肌肥大中，通過NF-κB信號通路，提升細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，從而起到抑制心肌肥大的作用[6]。在細胞凋亡調(diào)節(jié)過程中，糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)具有重要意義，而GSK-3β是PI3K/Akt信號通路的作用底物，激活的PI3K/Akt促進GSK-3β磷酸化，間接出現(xiàn)細胞凋亡減少。然而，PI3K/Akt信號通路是否參與CGA抑制心肌肥大少見報道。本研究通過H9c2大鼠心肌細胞建立ISO誘導(dǎo)的心肌肥大模型并應(yīng)用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002來觀察PI3K/Akt信號通路在CGA預(yù)處理抑制心肌肥大中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H9c2大鼠心肌細胞；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司;LY294002、p-Akt兔單克隆抗體、Akt兔多克隆抗體、山羊抗兔二抗；CCK-8細胞活力檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、ISO、CGA購自Sigma公司。細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司。

1.2 研究方法

1.2.1 H9c2細胞的培養(yǎng) H9c2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1×105U/L青霉素,100mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每2～3d換液，待細胞長到85%～90%時傳代。取對數(shù)生長期，生長良好的細胞進行實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測不同濃度CGA對H9c2細胞活力的影響 H9c2心肌細胞胰酶消化后使用完全培養(yǎng)基種于24孔板中,24h后換1%胎牛血清培養(yǎng)基。24h后分為對照組及CGA 10、50、100μmol/L培養(yǎng)基處理組。48h后吸棄細胞上清液,加入含10% CCK-8的完全培養(yǎng)基溶液培養(yǎng)2h后450nm波長下檢測吸光度(D450)。

1.2.3 心肌細胞肥大模型建立 H9c2心肌細胞胰酶消化后使用完全培養(yǎng)基種于24孔板中,24h后換1%胎牛血清培養(yǎng)基同步化。24h后分為對照組及2、5和10μmol/L濃度ISO處理組。48h后胰酶消化,采用Vicell細胞計數(shù)儀計數(shù)后進行蛋白質(zhì)含量檢測。

1.2.4 不同濃度CGA組心肌細胞表面積的測定設(shè)立CGA的濃度梯度為0、10、50、100μmol/L，正常對照組加同等體積的不含胎牛血清的DMEM，分別對H9c2心肌細胞進行處理。作用48h后計算各組心肌細胞表面積。

1.2.5 分組 將培養(yǎng)的H9c2心肌細胞隨機分為5組。(1) 空白對照組： 給予PBS 2mL DMEM完全培養(yǎng)基作為安慰劑，2h后置入2mL DMEM完全培養(yǎng)基中48h；(2) ISO組： 給予PBS 2mL后,10μmol/L ISO+2mL DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h；(3) ISO+CGA組： 10μmol/L ISO+100μmol/L CGA+2mL DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h；(4) ISO+CGA+LY294002組： 10μmol/L ISO+100μmol/L CGA+10μmol/L LY294002組+2mL DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h;(5) ISO+LY294002組： 10μmol/L ISO+10μmol/L LY294002組+2mL DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。

1.2.6 CCK-8檢測細胞存活率 將H9c2心肌細胞以6×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)72h后隨機分組并按照上述方法處理后,于每孔中加入10% CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1.5h,用酶標(biāo)儀檢測450nm波長下吸光度(D450)。細胞存活率%=(實驗組D450/對照組D450)×100%。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測心肌細胞活性氧類(ROS)含量 取對數(shù)生長期的H9c2心肌細胞,以1×106/孔接種于6孔板培養(yǎng)，分組處理后，置37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育30min,按照活性氧檢測試劑盒說明書操作,按1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋二氯二氧基熒光素-乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)，使其最終濃度為10μmol/L，去除細胞培養(yǎng)液,加入100μL稀釋好的DCFH-DA，用PBS洗滌細胞3次，用流式細胞儀檢測心肌細胞內(nèi)的熒光強度，其激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為510～540nm,測定的熒光強度與細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS呈正比關(guān)系。

1.2.8 流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡 將H9c2心肌細胞分組處理,置于5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),用Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒檢測細胞凋亡，各組細胞按實驗方法處理后,收集細胞用PBS洗滌1次，0.25%的胰酶消化收集心肌細胞并離心后棄上清液,再用PBS漂洗2次。用500μL結(jié)合緩沖液重懸細胞后，加入FITC標(biāo)記的Annexin-Ⅴ(40mg/mL)和PI(50mg/mL)各5μL,混勻后于室溫避光孵育15min，立即上流式細胞儀檢測各組心肌細胞凋亡水平。

1.2.9 Western印跡法檢測Caspase、Akt、p-Akt、Gsk-3β、p-Gsk-3β蛋白表達 將各組處理好的H9c2心肌細胞用0.25%胰酶消化后，用PBS洗滌3次，加入裂解液，4℃裂解30min,然后轉(zhuǎn)移至EP管中離心(離心半徑10cm，12000r/min，4℃，離心5min)，10min后取上清液，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白，加入5×上樣緩沖液煮沸5min。取30μg蛋白進行SDS-PAGE，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉室溫封閉1h,加入一抗(Akt 1∶1000、p-Akt 1∶1000),4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜后加入二抗(1∶3000)，室溫?fù)u床1h，用發(fā)光試劑對膜進行沖洗和浸泡,化學(xué)發(fā)光成像分析儀對條帶進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度CGA組心肌細胞表面積的測定

ISO顯著增加心肌細胞表面積50%，而CGA預(yù)處理之后可防止ISO誘導(dǎo)的細胞肥大(圖1A)。與無CGA預(yù)處理的ISO組相比，10μmol/L CGA的預(yù)處理組心肌細胞的表面積減少20%,50μmol/L CGA組心肌細胞的表面積減少30%，100μmol/L CGA預(yù)處理組細胞大小幾乎無變化，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B。從而選取100μmol/L CGA作為后續(xù)實驗的給藥劑量。

2.2 CGA預(yù)處理對H9c2心肌細胞活性的影響

與ISO組相比，100μmol/L的CGA能抑制ISO誘導(dǎo)的心肌肥大，細胞存活率明顯增加(P<0.05)；與CGA組相比，CGA+LY組細胞存活率明顯降低(P<0.05)，見圖2。

圖1 CGA對心肌細胞的預(yù)處理顯著抵抗 ISO誘導(dǎo)的肥大作用Fig.1 The pretreatment of cardiomyocytes by CGA significantly resists the effect of ISO-induced hypertrophyA： 熒光顯微鏡下觀察到的不同處理條件下細胞大??；B： Image J量化細胞面積；細胞區(qū)域由圖像J軟件測量；與對照組相比，#P<0.05；與ISO組相比，*P<0.05

圖2 各組心肌細胞活性Fig.2 Cell viability of groups與對照組相比，*P<0.05；與ISO組相比，#P<0.05；與ISO+CGA組相比，△P<0.05

2.3 CGA預(yù)處理減輕H9c2心肌細胞由ISO誘導(dǎo)的細胞凋亡

與空白對照組(9.6%±1.0%)相比，ISO組的凋亡率(30.5%±3.1%)明顯增加(P<0.05)；與ISO組相比，CGA處理組凋亡率(13.9%±1.5%)明顯增加(P<0.05)。與CGA處理組相比，ISO+CGA+LY294002組的凋亡率(20.1%±1.6%)明顯增加(P<0.05)，見圖3。

圖3 CGA對H9c2細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of CGA on H9c2 apoptosis與對照組相比，*P<0.05；與ISO組相比，#P<0.05；與ISO+CGA組相比，△P<0.05

2.4 CGA預(yù)處理降低H9c2心肌細胞ROS水平

ISO組熒光強度(212±36)與空白對照組(27±6)相比，細胞的ROS水平增加(P<0.05)；CGA預(yù)處理組(80±10)與ISO組相比，細胞的ROS水平減少(P<0.05)；LY294002組(168±17)與CGA預(yù)處理組相比，細胞的ROS水平增加(P<0.05)，見圖4。

2.5 CGA預(yù)處理對H9c2心肌細胞的Caspase、Akt、p-Akt、Gsk-3β、p-Gsk-3β蛋白表達的影響

與空白對照組相比，ISO組Caspase-3表達水平明顯升高(P<0.05)；p-Akt、p-Gsk-3β表達水平明顯降低(P<0.05)。與ISO組相比，CGA預(yù)處理組的Caspase-3表達水平明顯降低(P<0.05)；p-Akt、p-Gsk-3β表達水平明顯升高(P<0.05)。LY294002抑制了CGA對Akt與Gsk-3β的磷酸化作用(P<0.05)，見圖5。

圖4 CGA對ISO誘導(dǎo)的心肌細胞ROS水平的影響Fig.4 Effects of CGA on the level of ISO-induced ROS與對照組相比，*P<0.05；與ISO組相比，#P<0.05；與ISO+CGA組相比，△P<0.05

圖5 CGA對Caspase、Akt、p-Akt、Gsk-3β、 p-Gsk-3β蛋白表達水平的影響Fig.5 Effects of CGA on the level of Caspase, Akt, p-Akt, Gsk-3β, p-Gsk-3β

3 討 論

心肌細胞在出生后不久就會失去增殖能力，因此心臟缺乏修復(fù)氧化應(yīng)激引起的損傷的內(nèi)源性再生能力[7]。所以，本研究關(guān)注的是CGA對H9c2心肌細胞肥大的預(yù)防作用，而不是晚期的保護作用。CGA是肉桂酸衍生物，廣泛存在于植物葉、花和果實中，其中許多已經(jīng)被用作傳統(tǒng)中藥，并被報道有降低血壓、恢復(fù)血管彈性和保護心臟的功能[8-9]，但CGA對心肌細胞肥大的抑制作用少見報道。CGA可能是中藥中這些功能的重要的生物活性成分。

本研究主要證實了CGA預(yù)處理能抑制心肌肥大，且在此過程中，PI3K/Akt信號通路參與了CGA預(yù)處理對H9c2心肌細胞肥大的抑制作用。心力衰竭是一種不可逆的終末期心臟病。預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚是治療心力衰竭的最佳階段。目前，研究[10]表明，在ISO刺激下，CGA的預(yù)處理可有效抑制心肌細胞的肥大。CGA可能是治療心肌肥大的一種有前景的藥物。PI3K/Akt信號通路被認(rèn)為是細胞內(nèi)最重要的生存通路，其最明顯的作用是調(diào)節(jié)細胞凋亡過程，能夠抑制細胞凋亡[11]。動物實驗己經(jīng)證實藥物預(yù)處理可通過激活PI3K/Akt信號途徑在心肌細胞肥大中發(fā)揮重要作用，表現(xiàn)為增加細胞活性，抑制細胞凋亡[12-13]。PI3K/Akt/GSK-3β信號途徑在心肌細胞肥大中發(fā)揮重要作用,調(diào)節(jié)GSK-3β的活性可能會成為治療冠心病、心功能不全的新策略[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，ISO組細胞存活率明顯下降，產(chǎn)生的ROS增加，Caspase-3蛋白表達增加，心肌細胞凋亡明顯增加。給予CGA預(yù)處理后，心肌細胞存活率增加，凋亡率降低，Caspase-3蛋白表達降低；與ISO組相比具有明顯差異。本實驗還發(fā)現(xiàn)，CGA預(yù)處理可明顯抑制心肌細胞凋亡，應(yīng)用抑制劑LY294002,CGA的抑制作用消失，提示心肌細胞內(nèi)PI3K/Akt-Gsk-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與CGA抑制心肌肥大作用。結(jié)果顯示CGA預(yù)處理增加了p-Akt的表達，而阻斷劑LY294002抑制了Akt的磷酸化。Akt磷酸化的表達變化與抑制心肌細胞肥大的作用效應(yīng)是一致的，因此提示PI3K/Akt信號通路參與了CGA預(yù)處理對心肌肥大的抑制。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，CGA預(yù)處理可能通過激活PI3K/Akt信號通路參與抑制心肌細胞H9c2的心肌肥大，但是CGA預(yù)處理具體是激活了PI3K/Akt信號通路中哪些效應(yīng)分子還有待進一步研究。