郭振興， 張艷慧， 劉紹輝

(1. 同濟大學醫(yī)學院，上海 200092； 2. 山東省千佛山醫(yī)院兒科，濟南 250014)

自然殺傷(nature killer, NK)細胞是一類大顆粒淋巴細胞，表型為CD3-CD56+，發(fā)源于骨髓，主要分布于外周血、肝臟和脾臟[1-2]。在功能上，NK細胞介于固有免疫和適應性免疫之間，具有一定的記憶性[3-6]。然而NK細胞僅占人體外周血細胞的5%～15%，且大多數(shù)處于未激活狀態(tài)。NK細胞的體外擴增技術(shù)仍不成熟，限制了NK細胞臨床應用的普及[7-8]。

本方案采用飼養(yǎng)細胞(FC)來擴增外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中的NK細胞，通過FC胞膜表面所表達的表面分子與目的細胞的相互作用，選擇性地刺激目的細胞的增殖。Phan等[9]利用構(gòu)建的GE_K562細胞(K562-mbIL15-41BBL)共培養(yǎng)人PBMC 21d后，NK細胞增殖達到977倍左右[10]。本研究在此基礎上構(gòu)建了兩類FC，即第1代FC(FC-000，K562-41BBL)及第2代FC(FC-002，K562-41BBL-mbIL15-mbIL21)。兩者的主要區(qū)別是是否帶有膜結(jié)合型的IL-15及IL-21，這兩類細胞因子均具有促進NK細胞增殖的作用。本研究通過比較兩類FC對NK細胞增殖的影響并通過NK細胞群的表型鑒定、功能作用的驗證來確定最優(yōu)FC，以優(yōu)化NK細胞的擴增技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及細胞

人非小細胞肺癌細胞系A549于美國模式培養(yǎng)物集存庫獲得；FC是通過慢病毒轉(zhuǎn)導K562細胞系所構(gòu)建而來，即第1代FC(FC-000，K562-41BBL)及第2代FC(FC-002，K562-41BBL-mbIL15-mbIL21)；重組人白細胞介素2(rhIL-2)購自PeproTech公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)和青/鏈霉素購自Hyclone公司；慶大霉素購自上海中西制藥有限公司；淋巴細胞分離液購自CEDARLANE公司；吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)購自Nexcelom Bioscience公司；流式抗體均購于BD公司。

1.2 樣本及細胞培養(yǎng)方法

人PBMCs樣本來源于健康供體的新鮮外周血，將3mL外周血加入等體積的杜氏磷酸緩沖液(DPBS)稀釋后再與Lympholyte?-H按2∶1的體積進行密度梯度離心分選，室溫離心(800×g,20min)，收集PBMC層并用DPBS進行稀釋，再次離心(800×g,10min)，將細胞洗2～3次，然后用RPMI 1640培養(yǎng)液重懸。分離后的PBMC可用添加了10%胎牛血清(FBS)、10%DMSO的RPMI 1640培養(yǎng)液凍存液重懸，分裝后置于液氮罐中冷凍保存待用。

人非小細胞肺癌細胞系A549用含有10%FBS、100mg/L青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；FC用10%FBS、1%青/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，收獲細胞于輻照儀中100Gy輻照；FC、PBMC的共培養(yǎng)體系則是用含有300U/mL的rhIL-2、10U/mL慶大霉素、10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。以上細胞培養(yǎng)體系均置于含5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱里。

在實驗當天時，將供體PBMC以及輻照的兩類FC密度調(diào)整到1×106/mL后，分別按照1∶1的FC∶PBMC比例混合進行共培養(yǎng)。7d時，再次按照1∶1比例添加FC，每1～2d進行換液或補液；14d時，收獲細胞，統(tǒng)計并進行表型分析及殺傷實驗。設置不加FC的單獨PBMC組作為對照。

1.3 NK細胞表型及純度鑒定

分別在0、14d收集共培養(yǎng)體系中的細胞并調(diào)整至2×105/mL，將細胞分為3組，分別以標記anti-CD3、anti-CD56、anti-NKG2A、anti-NKG2C、anti-NKG2D、anti-CD94、anti-NKp30、anti-NKp44、anti-NKp46、anti-CD158a、anti-CD158b、anti-CD158e1、anti-CD69、anti-DNAM-1、anti-2B4抗體作為實驗組；以標記IgG1-APC、IgG1-PE、IgG2b-PE、IgM-FITC、IgG2b-BV650、IgG1-BV786、IgG1-BV421、IgG1-BV510組作為同型對照組；未加抗體組為陰性對照。4℃避光孵育30min后用含2%FBS的PBS洗2遍，重懸后上流式細胞儀進行檢測，利用FlowJo軟件進行數(shù)據(jù)的處理。培養(yǎng)體系中CD3-CD56+細胞的占比即為NK細胞的純度。

1.4 NK細胞的殺傷實驗

殺傷實驗利用艾森生物的實時無標記細胞分析儀(RTCA)進行，該細胞分析儀通過嵌在E-plate板上孔底的微電子感應器阻抗變化去感受細胞的有無以及貼壁、黏附和生長程度的改變，可實時、直觀地反映細胞增殖、存活、凋亡、形態(tài)變化等細胞生物學變化情況。13d時，收集A549細胞并調(diào)整密度為1×105/mL，然后向RTCA專用96孔板每孔加入100μL A549細胞懸液進行鋪板；14d時，收獲共培養(yǎng)體系中的細胞并用含rhIL-2的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為2×105/mL，然后分別按照效靶比E∶T為5∶1、1∶1、0.2∶1的比例添加NK細胞，殺傷體系終體積200μL(含300U/mL rhIL-2、10%FBS、100mg/L青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM)，設置未加NK細胞的A549組作為對照組；所有組均設置復孔。加入NK細胞2h后，計算殺傷效率，所得實驗數(shù)據(jù)(細胞指數(shù)、殺傷時間等)采用RTCA Software 2.0軟件進行處理。殺傷72h后，收集殺傷體系上清液，利用流式檢測干擾素-γ(IFN-γ)的表達水平，分析其平均熒光強度(mean fludrescence intensity, MFI),MFI值的高低代表著NK細胞分泌IFN-γ的能力強弱。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 FC-002及FC-000體外擴增NK細胞倍數(shù)及純度

FC-000表達細胞共刺激配體41BBL，但不表達mbIL21和mbIL15，見圖1A；FC-002同時表達41BBL、mbIL21、mbIL15，見圖1B，證明此批FC構(gòu)建成功。與對照組相比，兩類FC均能刺激NK細胞的擴增。但FC-002對NK細胞的擴增倍數(shù)(3325倍)優(yōu)于FC-000(10倍)(P<0.05)，見圖1C。且FC-002擴增的NK細胞純度(93.5%)也高于FC-000所擴增的NK細胞純度(70.2%)(P<0.05)，見圖1D。表明FC-002體外擴增NK細胞效果優(yōu)于FC-000。

圖1 FC表型及共培養(yǎng)14d后NK細胞的擴增倍數(shù)及純度Fig.1 The expansion fold and purity of NK cells in co-culture systemA： FC-000表型;B： FC-002表型;C： 共培養(yǎng)14d的NK細胞擴增倍數(shù)；D： 共培養(yǎng)14d的NK細胞純度

2.2 FC-002促進具有特定功能性受體的NK細胞群增殖

與對照組相比，兩類FC與PBMCs共培養(yǎng)14d后，F(xiàn)C-000刺激擴增的NK細胞的NKG2D、NKp44、CD69、CD158a分別上升30%、49%、45%、28%(P<0.05)，F(xiàn)C-002刺激擴增的NK細胞的NKG2D、NKp44、CD69分別上升43%、65%、46%(P<0.05)，CD158a則為4%(P>0.05)，見圖2。

2.3 FC-002擴增的NK細胞腫瘤殺傷及IFN-γ表達能力

加入NK 2h后，與對照組相比，E∶T=5∶1時，F(xiàn)C-002的NK細胞殺傷效率(95%)高于FC-000的NK細胞(33%)(P<0.05)；E∶T=1∶1時，F(xiàn)C-002的NK細胞殺傷效率(45%)高于FC-000的NK細胞(13%)(P<0.05)。E∶T=0.2∶1時，F(xiàn)C-002的NK細胞殺傷效率(21%)高于FC-000的NK細胞(0%)(P<0.05)(圖3A、圖3B)。與此同時，F(xiàn)C-002擴增的NK細胞殺傷腫瘤細胞時具有更高的IFN-γ表達能力，為FC-000的NK細胞表達能力的4倍(P<0.05)，見圖3C、圖3D。

圖2 NK細胞功能性受體分析Fig.2 Functional receptor analysis of NK cells

圖3 NK細胞對A549的殺傷能力Fig.3 Killing effect of NK cells on A549 A： RTCA檢測兩種NK細胞對A549生長的影響;B： 加入NK 2h后的殺傷效率;C： 殺傷72h后上清液IFN-γ水平比較;D： IFN-γ表達的MFI

3 討 論

NK細胞是一種大顆粒淋巴細胞，不需要預先致敏、無主要組織相容性復合體(MHC)限制性，能夠?qū)Ω鞣N外來抗原、自身突變細胞等進行非特異的殺傷，在機體免疫系統(tǒng)中起重要作用[11-13]；近年，Bjorklund等[14]利用NK細胞對16例骨髓增生異常綜合征/急性髓性白血病(MDS/AML)患者進行免疫細胞治療，其中6例患者取得了完全緩解及部分緩解，3例在治療后3年仍未復發(fā)，證明了NK細胞臨床治療腫瘤的潛力。當前體外擴增NK細胞的方法主要分為2種，一種是聯(lián)合細胞因子IL-12、IL-15、IL-18等進行擴增[15-18]，Torelli等[19]利用IL-2、IL-15共培養(yǎng)PBMC 2周，NK細胞增殖16倍。另一種方法是利用FC刺激NK細胞擴增，Pahl等[20]利用構(gòu)建的GE_K562細胞(K562-mbIL15-41BBL)共培養(yǎng)人PBMC 21d后，NK細胞增殖達到977倍。到目前為止，采用FC進行NK細胞擴增的方案在擴增倍數(shù)和純度上要優(yōu)于聯(lián)合細胞因子的擴增方案,但仍具有很大的優(yōu)化空間。

FC主要利用慢病毒等載體將特定基因轉(zhuǎn)導入某些腫瘤細胞株，使其細胞表面表達出特定的蛋白等小分子物質(zhì)，再采用X射線輻照，使得這類轉(zhuǎn)導后的細胞失去增殖能力，同時仍保留完整的細胞膜表面，F(xiàn)C胞膜上的功能性配體可選擇性地激活PBMC中的NK細胞，從而實現(xiàn)NK細胞的擴增。擴增活化效果主要與FC胞膜表達的功能配體分子組合有關(guān)[21]。本研究構(gòu)建了第1代FC(FC-000，K652-41BBL)和第2代FC(FC-002，K562-41BBL-mbIL15-mbIL21)，兩者的主要區(qū)別是是否帶有膜結(jié)合型的IL-15及IL-21，這兩類細胞因子均具有促進NK細胞增殖的作用[22]。通過實驗發(fā)現(xiàn)FC-002能夠在14d內(nèi)將NK細胞擴增倍數(shù)提高到3300倍左右，遠高于FC-000，且優(yōu)于Phan等[9]體外擴增NK細胞的方案。

NK細胞發(fā)揮作用依賴于細胞表面多種受體的影響，如NKG2D、NKG2A、NKG2C、NCRs、KIRs、DNAM-1、2B4等[23-24]，這些信號綜合決定了NK細胞是否發(fā)揮作用。除此之外，兩類FC均能夠選擇性擴增具有功能性受體NKG2D、NKp44、CD69的NK細胞群，NKG2D和NKp44作為激活性受體，能夠激活NK細胞，使其發(fā)揮殺傷作用；CD69作為NK、T細胞的激活性標志[25-27]，表明本方案體外擴增的NK細胞得到激活。IFN-γ是由NK細胞分泌的一種細胞因子,其對于天然免疫與適應性免疫抵抗病毒、細菌的感染起關(guān)鍵作用。體外殺傷效果顯示，F(xiàn)C-002擴增的NK細胞在殺傷能力及IFN-γ表達能力上均優(yōu)于FC-000；而FC-000所擴增的NK細胞群帶有抑制性受體CD158a的表達，F(xiàn)C-002對于表達CD158a的NK細胞群則無增殖效應，提示CD158a抑制性受體的表達抑制了NK細胞的殺傷活性，而在FC上構(gòu)建膜結(jié)合型的IL-15及IL-21則不會促使表達這類受體的NK細胞增殖。

總之，本研究方案通過對兩種FC的比較，證明了第2代FC(FC-002)無論是在NK細胞的體外擴增上，還是NK細胞純度、NK細胞殺傷效率及IFN-γ表達能力上均優(yōu)于第1代FC(FC-000)。FC-002能夠顯著提高NK細胞的擴增倍數(shù)，并促進了具有NKG2D、NKp44、CD69功能性受體的NK細胞群的擴增。NK細胞體外擴增技術(shù)及其在腫瘤臨床治療方面的安全性、有效性和免疫生物學相關(guān)性仍需繼續(xù)研究和完善，相信NK細胞的臨床應用會隨之逐漸普及。