楊春雪， 張 圓， 汪園圓， 韓洪秀

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院病理科，上海 200011)

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明在多種腫瘤組織中存在神經(jīng)新生，例如前列腺癌[1-2]、結(jié)腸癌[3]、乳腺癌[4]和胰腺癌[5-6]等，然而口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)組織中的神經(jīng)新生與疾病進(jìn)展的關(guān)聯(lián)少見(jiàn)報(bào)道。因此本研究首先在人OSCC標(biāo)本中檢測(cè)泛神經(jīng)標(biāo)記物蛋白基因產(chǎn)物(protein gene product, PGP)9.5表達(dá)特點(diǎn)以揭示OSCC神經(jīng)新生與疾病進(jìn)展的相關(guān)性。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的本質(zhì)特征，支配腫瘤組織的神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有一定影響[7]。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)是一種含有37個(gè)氨基酸殘基的神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及包括頭頸部在內(nèi)的外周神經(jīng)末梢[8-9]。Nagakawa等[10]通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CGRP能增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力，也有研究[11]認(rèn)為內(nèi)源性CGRP可能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和血管新生。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，主要包括ERK、p38和JNK等3種，可被神經(jīng)遞質(zhì)或細(xì)胞因子激活發(fā)生磷酸化，參與調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞諸如人肺腺癌細(xì)胞[12]、骨肉瘤細(xì)胞[13]、結(jié)腸癌細(xì)胞[14]等的增殖、遷移和侵襲。目前并未在人OSCC中檢測(cè)出CGRP的表達(dá)，這可能是抗體的有限性導(dǎo)致的。為了揭示OSCC組織中新生神經(jīng)釋放的神經(jīng)遞質(zhì)在疾病進(jìn)展中的可能作用機(jī)制，本研究利用培養(yǎng)舌SCC細(xì)胞株初步探討CGRP對(duì)OSCC細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院人OSCC石蠟包埋組織樣本，排除放療、化療或其他外科手術(shù)外治療的患者，共167例，常規(guī)進(jìn)行切片、HE染色。根據(jù)頭頸部腫瘤WHO分類(lèi)，對(duì)樣本腫瘤進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)。患者年齡23～81歲，平均(59±27.5)歲，102例(61.0%)患者無(wú)病存活期在3年以上。回顧總結(jié)患者臨床病理學(xué)指標(biāo)，包括腫瘤大小、有無(wú)血管浸潤(rùn)、神經(jīng)浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。

1.1.2 細(xì)胞系 人舌SCC細(xì)胞株TSCCA購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用藥 CGRP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。ERK抑制劑PD98059、p38抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125購(gòu)自英國(guó)Tocris公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 MEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；兔單克隆抗體p-ERK、兔單克隆抗體p-p38、兔單克隆抗體p-JNK購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.1.5 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；全自動(dòng)酶標(biāo)光度儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司；多功能成像儀購(gòu)自美國(guó)GE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)方法 存檔腫瘤組織蠟塊，切白片，切片置于60℃烘箱烤片2h后，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。組織切片于3% H2O2中室溫孵育10min，雙蒸水沖洗后放入預(yù)熱(100℃)的EDTA抗原修復(fù)液中孵育10min。自然冷卻至室溫，于兔抗人PGP9.5多克隆抗體(1∶500)4℃孵育過(guò)夜，于EnVision通用型抗兔/鼠二抗室溫孵育1h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、水洗，脫水后樹(shù)膠封片。空白對(duì)照用PBS代替一抗。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判讀 用Optimas 6 Image Analyse Suite評(píng)估神經(jīng)束的直徑，大多數(shù)(96.1%)神經(jīng)束直徑<100μm。通過(guò)在200倍高倍鏡視野下連續(xù)20個(gè)視野計(jì)數(shù)直徑<100μm的神經(jīng)纖維束來(lái)分析PGP9.5的表達(dá)強(qiáng)弱。將PGP9.5表達(dá)程度分為3類(lèi)。(1) 陰性： 既無(wú)神經(jīng)束也無(wú)散在的神經(jīng)纖維；(2) 弱陽(yáng)性： 1～10個(gè)神經(jīng)束；(3) 中/強(qiáng)陽(yáng)性： >10個(gè)神經(jīng)束。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)TSCCA細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Transwell小室細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn)： 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/mL，接種200μL細(xì)胞懸液于孔徑為8μm的聚碳酸酯的Transwell小室上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基500μL，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，然后用4%多聚甲醛固定10min，結(jié)晶紫染色20min，PBS洗3次，棉棒擦除小室上層的細(xì)胞，于倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)遷移到小室下的細(xì)胞數(shù)，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。侵襲實(shí)驗(yàn)： 在Transwell小室上鋪60μL的Matrigel膠(1∶8稀釋)，待膠凝固后，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×106/mL，接種到小室上室，余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。為了檢測(cè)CGRP對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響，100nmol/L CGRP(溶于0.1% DMSO)加入小室下室，對(duì)照組(control)為加入等體積的0.1% DMSO；為了檢測(cè)ERK/p38/JNK抑制劑對(duì)CGRP效應(yīng)的影響，分別在小室上室加入PD98059、SB203580和SP600125(10mol/L，溶于1% DMSO)，對(duì)照組(control)加入等體積的1% DMSO。

1.2.5 免疫印跡檢測(cè) 提取總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，冰浴下130mA轉(zhuǎn)膜100min，于5%脫脂牛奶室溫封閉1h，于兔抗p-ERK(1∶500)、兔抗p-p38(1∶500)或兔抗p-JNK(1∶500)4℃搖床孵育過(guò)夜；第2天轉(zhuǎn)入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶3000)室溫孵育1h，化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，利用多功能成像儀掃描目的條帶和對(duì)照條帶，然后用Image J軟件測(cè)算條帶的密度，計(jì)算相對(duì)變化值(目的條帶與對(duì)照條帶之比)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 人OSCC組織中的神經(jīng)新生

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，88.0%(147/167)的人OSCC組織中可見(jiàn)PGP9.5表達(dá)，神經(jīng)束片段或纖細(xì)的神經(jīng)纖維大多分布于腫瘤間質(zhì)，也可見(jiàn)細(xì)小的神經(jīng)纖維包繞于癌細(xì)胞周?chē)?，癌旁正常黏膜上皮下組織中均可見(jiàn)神經(jīng)束分布(圖1)。82.6%(138/167)的癌旁正常黏膜上皮下組織中PGP9.5的表達(dá)為弱陽(yáng)性，而49.7%(83/167)的人OSCC組織中PGP9.5的表達(dá)為中/強(qiáng)陽(yáng)性(P<0.0001)。不同解剖部位的OSCC組織中PGP9.5的陽(yáng)性表達(dá)情況如下： 舌SCC 89.2%(66/74)，頰SCC 83.3%(20/24)，唇SCC 83.3%(5/6)，口底SCC 95.0%(19/20)，咽和喉SCC 92.3%(12/13)，牙齦SCC 89.5%(17/19)，頜SCC 72.7%(8/11)。不同部位的OSCC的PGP9.5的陽(yáng)性表達(dá)情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2 人OSCC組織中的神經(jīng)新生與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系

在OSCC 1級(jí)組織中PGP9.5的中/強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率為21.7%(15/69)，而在2、3級(jí)組織中PGP9.5中/強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率明顯提高為69.4%(68/98)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。在無(wú)神經(jīng)浸潤(rùn)的組織中PGP9.5中/強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率為45.5%(61/134)，而在有神經(jīng)浸潤(rùn)的組織中表達(dá)率增高為66.7%(22/33)(P=0.034)。無(wú)病生存期<3年的患者的PGP9.5中/強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率(61.6%，40/65)高于無(wú)病生存期≥3年的患者(42.2%，43/102)(P=0.017)。PGP9.5的中/強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分級(jí)、神經(jīng)浸潤(rùn)和患者短生存期正相關(guān)(r=0.425、0.166、0.186，均P<0.05)。然而，PGP9.5的中/強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)無(wú)關(guān)(均P>0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 人口腔鱗狀細(xì)胞癌及周?chē)＝M織中 PGP 9.5的表達(dá)Fig.1 The expression of PGP9.5 in human OSCC and adjacent normal tissuesA： 人口腔鱗狀細(xì)胞癌的H-E染色；B： 腫瘤周?chē)＝M織內(nèi)的PGP9.5表達(dá)；C、D： 腫瘤組織內(nèi)PGP9.5的表達(dá)；標(biāo)尺： A： 100μm；B～D： 50μm

2.3 CGRP促進(jìn)TSCCA細(xì)胞遷移和侵襲

CGRP是一種廣泛分布于中樞和外周的神經(jīng)遞質(zhì)。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CGRP濃度依賴(lài)性(1、10、100nmol/L)促進(jìn)TSCCA細(xì)胞的遷移和侵襲，100nmol/L CGRP的效應(yīng)最顯著，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用100nmol/L CGRP刺激細(xì)胞。相比對(duì)照組，CGRP處理組的細(xì)胞遷移到小室下的數(shù)目明顯增多(CGRP： 165.4±14.2，對(duì)照： 110.2±5.3)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。同樣，利用侵襲實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)CGRP處理的細(xì)胞侵襲到小室下的數(shù)目明顯增多(CGRP： 68.3±23.5，對(duì)照： 12.8±2.8)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，見(jiàn)圖2。

表2 PGP9.5的表達(dá)與人口腔鱗狀細(xì)胞癌組織 臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系

圖2 100nmol/L CGRP促進(jìn)TSCCA細(xì)胞的遷移和侵襲Fig.2 The migration and invasion of TSCCA cells were promoted by 100 nmol/L CGRP標(biāo)尺： 100μm；與對(duì)照組相比，***P<0.001

2.4 CGRP對(duì)ERK、p38和JNK磷酸化表達(dá)的影響

CGRP處理TSCCA細(xì)胞1h后，其p-ERK的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯升高(P=0.007)，但CGRP處理6、24h后，其p-ERK的表達(dá)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A)。CGRP處理6h后細(xì)胞p-p38的表達(dá)水平高于對(duì)照組(P=0.043)，但CGRP處理1、24h后，其p-p38的表達(dá)水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)。CGRP處理24h后細(xì)胞p-JNK的表達(dá)高于對(duì)照組(P=0.035)，但CGRP處理1、6h后，p-JNK的表達(dá)水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3C)。

圖3 100nmol/L CGRP刺激TSCCA細(xì)胞1、6和24h后 p-ERK (A)、p-p38 (B)和p-JNK (C)蛋白水平的表達(dá)Fig.3 The expression of p-ERK (A), p-p38 (B) and p-JNK (C) in TSCCA cells at 1, 6 and 24 h after stimulation by 100 nmol/L CGRP與對(duì)照組相比，*P<0.05,***P<0.001

2.5 ERK、p38和JNK抑制劑對(duì)CGRP促進(jìn)TSCCA細(xì)胞遷移和侵襲的影響

1μmol/L的ERK抑制劑PD98059、p38抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125均不影響CGRP的效應(yīng)。而10μmol/L的SP600125明顯減弱CGRP引起的TSCCA細(xì)胞的遷移(SP600125： 94.5±15.5，對(duì)照： 142.5±20.8，P=0.028)和侵襲(SP600125： 52.5±16.5，對(duì)照： 118.4±38.1，P=0.029)，10μmol/L的PD98059和SB203580對(duì)CGRP引起的TSCCA細(xì)胞遷移和侵襲沒(méi)有影響(圖4)。

圖4 10mol/L SP600125減弱CGRP引起 TSCCA的遷移和侵襲Fig.4 CGRP-stimulated migration and invasion of TSCCA cells were attenuated by 10 mol/L SP600125標(biāo)尺： 100μm；與對(duì)照組相比，*P<0.05

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)88.0%(147/167)的人OSCC組織中可能存在新生神經(jīng)，神經(jīng)束片段或纖細(xì)的神經(jīng)纖維大多分布于腫瘤間質(zhì)中，也可見(jiàn)細(xì)小的神經(jīng)纖維包繞于癌細(xì)胞。這與之前研究中前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌等組織出現(xiàn)神經(jīng)新生相一致[1-6]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)OSCC比癌旁正常黏膜上皮下組織中神經(jīng)纖維數(shù)目增多。

Magnon等[15]認(rèn)為在小鼠前列腺癌組織中出現(xiàn)的交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)是前列腺癌發(fā)生發(fā)展中所必需的。最近，Zhao等[16]利用小鼠胃癌模型證明去神經(jīng)支配能抑制胃癌發(fā)生。這些證據(jù)提示腫瘤組織中的神經(jīng)新生可能在疾病進(jìn)展中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)OSCC組織中PGP9.5的中/強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)與神經(jīng)浸潤(rùn)相關(guān)，提示OSCC中的神經(jīng)新生可能在癌細(xì)胞侵襲過(guò)程中起一定作用，這與Entschladen等[17]的觀點(diǎn)一致： 癌癥相關(guān)的神經(jīng)新生很可能促進(jìn)了癌細(xì)胞神經(jīng)浸潤(rùn)的發(fā)生，從而成為癌組織中神經(jīng)上皮相互作用的第二步。此外，本研究顯示OSCC的神經(jīng)新生與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)和患者的無(wú)病生存期呈正相關(guān)；這表明新生神經(jīng)可能是促進(jìn)人OSCC的進(jìn)展因素之一。然而，本研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)新生與OSCC腫瘤大小、血管浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制非常復(fù)雜，與癌組織增大、癌細(xì)胞遷移和侵襲能力及其與轉(zhuǎn)移部位微環(huán)境之間的相互作用密切相關(guān)，參與調(diào)控的分子復(fù)雜多樣[18-19]。推測(cè)支配OSCC的神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì)促進(jìn)癌細(xì)胞向不同部位(血管、淋巴、神經(jīng))轉(zhuǎn)移與其和轉(zhuǎn)移部位微環(huán)境之間的相互作用不同有關(guān)，這尚進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

越來(lái)越多研究證明神經(jīng)遞質(zhì)在腫瘤的微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，加速了腫瘤的進(jìn)展。例如，神經(jīng)遞質(zhì)參與腫瘤的免疫抑制[20]，腫瘤的血管化和血管密度的改變受神經(jīng)遞質(zhì)的影響[21-22]。因此，本研究利用舌SCC細(xì)胞株間接從細(xì)胞水平探討CGRP對(duì)OSCC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CGRP能促進(jìn)TSCCA細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從細(xì)胞水平直接證明神經(jīng)遞質(zhì)可能促進(jìn)了OSCC細(xì)胞的和轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。這與Nagakawa等[10]報(bào)道CGRP能增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力相一致。另外，本研究發(fā)現(xiàn)CGRP可使TSCCA細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的三條主要信號(hào)通路ERK、p38和JNK發(fā)生磷酸化。但由于刺激細(xì)胞時(shí)間不同，MAPKs信號(hào)通路分子的表達(dá)情況有所不同。CGRP作用1h后p-ERK的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組；CGRP作用6h后p-p38的表達(dá)水平高于對(duì)照組；而CGRP作用24h后p-JNK的表達(dá)水平高于對(duì)照組。有研究表明苦參堿通過(guò)p38通路抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移[23]，與本研究不同；這可能是由于ERK、p38和JNK激活在細(xì)胞增生、遷移、侵襲和死亡中的作用不同，與細(xì)胞種類(lèi)、刺激條件、刺激時(shí)間不同有關(guān)[24]。有研究表明，外源性CGRP改善缺血/再灌注誘導(dǎo)的大腦組織損傷是通過(guò)下調(diào)p-JNK/p38和上調(diào)p-ERK實(shí)現(xiàn)的[25]。本研究提示，CGRP均能引起p-ERK、p-p38和p-JNK上調(diào)，但具有不同的時(shí)間依賴(lài)性。為了明確是哪種MAPKs信號(hào)通路參與了CGRP引起的TSCCA細(xì)胞的遷移和侵襲，本研究給予MAPK信號(hào)通路相應(yīng)信號(hào)元件抑制劑切斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)JNK抑制劑SP600125減弱了CGRP引起的舌SCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而ERK抑制劑PD98059和P38抑制劑SB203580對(duì)CGRP引起舌SCC細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力無(wú)影響。因此，認(rèn)為JNK信號(hào)分子的活化可能介導(dǎo)了CGRP對(duì)OSCC細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用。

綜上，OSCC組織中確實(shí)存在神經(jīng)新生，而且其與OSCC的進(jìn)展密切相關(guān)。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)提示神經(jīng)遞質(zhì)促進(jìn)OSCC細(xì)胞遷移和侵襲；這些研究結(jié)果表明神經(jīng)新生可能在OSCC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。