賈艷艷，杜小鳳，施洪泉，高懷中，孔祥仕，顧大路，楊文飛，諸 俊，王偉中*

(1. 江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 淮安 223001；2. 南京大學(xué)，江蘇 南京 210093)

【研究意義】稻-麥輪作是江蘇省糧食生產(chǎn)的主要耕作制度，其稻茬麥面積占小麥播種面積的70 %以上[1]。近年來隨著水稻產(chǎn)量水平的不斷提高，其副產(chǎn)品秸稈量也隨之增大，秸稈就地還田成為秸稈綠色處理、維持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要手段[2]。越來越多的秸稈在農(nóng)田土壤中被分解。作物秸稈的分解過程主要是在土壤微生物及其分泌的各種酶系統(tǒng)作用下將復(fù)雜的有機化合物分解為簡單的小分子來完成的[3-4]。而土壤的生化過程受控于酶的催化活性，因此土壤微生物的生物活性、群落結(jié)構(gòu)組成及其代謝酶的多樣性決定著秸稈在土壤中的分解狀態(tài)和最終的還田效果。叢枝菌根(Arbuscularmycorrhizal，AM)真菌是土壤微生物區(qū)系中分布最廣泛的一類真菌，能與80 %的陸生植物形成共生體。這種共生體的互利性是通過雙向營養(yǎng)交換來體現(xiàn)的：植物通過光合作用給菌根真菌提供碳水化合物，而菌根真菌通過其強大的外部菌絲系統(tǒng)提高植物對土壤礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收，增強植物對外界不良環(huán)境的抵抗能力[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】一般認(rèn)為AM真菌營專性活體共生，不具腐生性。自Hodge等在Science中從報道了AM真菌可加速有機物分解后，AM真菌對凋落物分解的積極作用日益受到重視[6]。Cheng等發(fā)現(xiàn)增加二氧化碳濃度后AM真菌能通過促進(jìn)作物光合產(chǎn)物的釋放來調(diào)控分解系統(tǒng)，推測AM真菌與分解系統(tǒng)之間存在供求關(guān)系[7]。分根裝置對AM真菌與凋落物的分解關(guān)系研究也證明了接種AM真菌能夠通過提高土壤酶活性、增加微生物量的大小和活性作用于玉米秸稈[8-9]和蠶豆秸稈[10]的分解過程，加快秸稈的分解。本課題組最新研究發(fā)現(xiàn)，在中等土壤養(yǎng)分環(huán)境中，AM真菌通過增大菌絲密度和硝酸還原酶的活性顯著促進(jìn)了栓皮櫟凋落葉的分解速率[11]。【本研究切入點】水稻是全球產(chǎn)量最大的糧食作物，還田稻稈的分解對整個農(nóng)田土壤的養(yǎng)分含量具有主導(dǎo)和支配作用。接種AM真菌是否會影響農(nóng)田稻稈的分解過程，對深入理解AM真菌在農(nóng)田土壤養(yǎng)分循環(huán)系統(tǒng)中的作用有重要意義。目前為止，稻-麥輪作農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)中AM真菌對還田稻稈分解過程的影響還缺少深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗以盆栽小麥作為宿主植物研究了接種AM真菌對還田稻稈分解的影響，通過測定分解速率、土壤微生物量和分解酶活性的變化情況，解析AM真菌對稻稈分解的作用及影響機理。研究為AM真菌對還田稻稈的有效分解和元素轉(zhuǎn)化機制提供基本參考依據(jù)，對于維持農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動及提高農(nóng)田土壤肥力具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤：盆栽用土采集自淮安市農(nóng)科院科研創(chuàng)新基地稻田(119°03′57″E, 33°52′89″N)。土壤類型為沙壤土，肥力中等，pH 7.65。土壤(0～20 cm)有機質(zhì)含量22.84 g·kg-1，全氮1.26 g·kg-1，速效磷46. 27 mg·kg-1，速效鉀85.35 mg·kg-1。采集的土壤風(fēng)干后過2 mm篩，在121 ℃下濕熱滅菌2 h備用。

宿主作物：小麥種子為淮麥30號。播種期為10月底，種子以10 % H2O2表面消毒10 min，用去離子水反復(fù)清洗數(shù)遍后，瀝干水分備用。

供試秸稈：為新鮮收獲的南粳9108地上部分稻稈，統(tǒng)一切割長度(10 ± 2 cm小段)，室內(nèi)60 ℃烘干后備用。

供試菌劑：摩西球囊霉Glomusmosseae、根內(nèi)球囊霉G.intraradices和幼套球囊霉G.etunicatum。菌種購買自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所。菌種預(yù)先經(jīng)高粱盆栽繁殖，接種菌劑含有擴繁后產(chǎn)生的相應(yīng)基質(zhì)以及AM真菌孢子、根外菌絲和植物根段，每克菌劑含有10～20個孢子。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用室內(nèi)盆栽法。所用塑料盆大小為30 cm口徑 × 30 cm高，每盆放置4.5 kg滅菌土。試驗設(shè)置4個處理，以滅菌處理接種為對照，分別為：小麥 +G.mosseae(GM)、小麥 +G.intraradices(GI)、小麥 +G.etunicatum(GE)和小麥 + 滅菌菌劑對照(CK)，每個處理3個重復(fù)。土壤施肥量按照高產(chǎn)小麥栽培肥料運籌方案肥量進(jìn)行施肥，純氮250 kg·hm-2、純磷 8 kg·hm-2、純鉀 9 kg·hm-2，基追比例為5∶5(苗肥∶拔節(jié)肥∶孕穗肥 = 5∶1.5∶3.5)。

盆栽中稻稈還田量參考已報道的水稻草谷比，模擬以中量級8000 kg·hm-2還田量在盆深15 cm土層處網(wǎng)袋法直接還田。各盆土壤放置稻稈后在盆深10 cm處進(jìn)行菌劑接種處理。小麥以10粒/盆進(jìn)行盆栽，出苗后定苗5株。所有盆栽置于作調(diào)中心人工氣候室中隨機排列，生長期間控制土壤含水量保持在60 % ～70 %，室溫維持在25～30 ℃，光照時間為10 h·d-1。試驗共持續(xù)7個月，期間每月取樣1次。共設(shè)置84個盆栽(4個處理 × 3個重復(fù) × 7次取樣)。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 菌根侵染率的測定 將小麥根系洗凈，剪成 0.5～1 cm左右長度，放入試管或者其它染色容器內(nèi)，加入10 %的KOH溶液，于90 ℃水浴鍋內(nèi)脫30～60 min，后再用水將堿液沖洗3次；用濃度為2 %的HCl溶液浸泡3～5 min，洗凈。用酸性品紅染色溶液染色根段，于90 ℃水浴鍋中染色20～30 min。用鑷子挑選染色后的根系，整齊擺放于載玻片上，加蓋潔凈的蓋玻片，采用方格交叉法測定小麥根系的菌根侵染率。

1.3.2 秸稈剩余量和土壤胞外酶測定 秸稈剩余量測定：在第7個月最后1次取樣后小心去除盆栽秸稈表面的土壤，60 ℃烘干至恒重后稱量秸稈剩余量。

土壤微生物呼吸量的測定：采用底物誘導(dǎo)呼吸方法[12]。將1.0 g新鮮土樣加入100 mL的西林瓶中，加入1 mL 0.01 g·mL-1的葡萄糖溶液，在通風(fēng)處敞口放置30 min，測定瓶內(nèi)CO2濃度(μl·L-1)。封口25 ℃培養(yǎng)1 h后，再測1次CO2濃度，計算出前后2次差值。土壤微生物量單位定義為1 g土樣1 h內(nèi)分解0.01 g葡萄糖所產(chǎn)生的CO2量。

室內(nèi)實驗在江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)科所中心實驗室進(jìn)行，所用溶液和化學(xué)試劑均為國藥分析純。

1.4 數(shù)據(jù)分析

7個月后的分解率根據(jù)Olson[19]的方法計算，計算公式為：

k= -ln(xt/x0)/t

式中，k為稻稈分解率(月-1)，x0為稻稈的初始質(zhì)量，xt為“t”個月(本文中t= 7)后凋落物的剩余量。

試驗數(shù)據(jù)采用SPASS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，5 %水平下Tukey HSD檢驗各處理平均值之間的差異顯著性。所有的圖片在Origin 2016軟件中制作完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種菌劑的侵染率

菌根侵染率是菌株在土壤中與宿主共生生長狀況的重要指示參數(shù)。由圖1可以看出，3種菌根真菌接種小麥后在前3個月快速生長，侵染率不斷增加，在第4個月達(dá)到高峰，并一直持續(xù)到第7個月。

圖1 接種叢枝菌根真菌后小麥根系侵染率變化(SD,n=3)Fig.1 Changes in the infection rate of wheat roots after being inoculated withArbuscular mycorrhizalfungi

其中侵染共生效果最好的是接種摩西球囊霉菌的GM處理，在第4個月達(dá)到92.17 %，其次是GI，第4個月的侵染率達(dá)90.31 %。GE處理幼套球囊霉菌的侵染效率最低，在第5個月達(dá)到84.21 %的侵染率。因此在當(dāng)?shù)赝寥拉h(huán)境中摩西球囊霉菌和根內(nèi)球囊霉菌較適合與淮麥30小麥形成菌根共生體。

2.2 接種AM真菌對還田稻稈分解率的影響

分解系數(shù)是衡量分解速率的一個指標(biāo)，分解系數(shù)越大其分解速度就越快。由表1可以看出，經(jīng)過7個月的盆栽分解實驗，接種AM真菌的各處理水稻秸稈的分解系數(shù)均高于對照處理，其中GM和GI接種處理對稻稈分解速率的促進(jìn)效果表現(xiàn)顯著，增幅分別為26.51 %和16.27 %(P< 0.05)。GE處理下的稻稈分解系數(shù)為0.172，雖然高于對照0.166，但無顯著差異。該結(jié)果表明接種叢枝菌根真菌能加快水稻秸稈的分解速度，提高稻稈中元素的礦化速率。

2.3 接種AM真菌對土壤微生物呼吸量的影響

土壤呼吸是評價土壤基質(zhì)中碳穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。土壤呼吸的強度反映了土壤中微生物活性以及對有機質(zhì)殘體分解的速度。土壤呼吸數(shù)值越大，土壤微生物量越大，活性也越強。圖2數(shù)據(jù)顯示，接菌處理在前2個月對土壤呼吸值的影響較小，無顯著差異變化；從第3個月開始各接菌處理下土壤呼吸值均顯著增加(第5個月的GM、GE處理和第6個月的GI、GE處理除外)，說明隨著菌根真菌的成功定殖，AM真菌促進(jìn)了土壤微生物的生物量的增加。在同一取樣時間下，GM處理的盆栽土壤呼吸值均高于其他處理(第5個月除外)，GI的次之，各處理土壤呼吸量總體趨勢為GM>GE>GI>CK，可見接種摩西球囊霉菌對土壤微生物活性的促進(jìn)作用要優(yōu)于幼套球囊霉菌和根內(nèi)球囊霉菌。

表1 接菌處理7個月后秸稈的分解系數(shù)(k，月-1)

注：同行不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P< 0.05，SD,n= 3)。

Note: Different lowercase letters on the same line indicate significant differences among different treatments (P< 0.05，SD,n= 3).

圖2 接種叢枝菌根真菌后稻稈周圍土壤微生物呼吸量變化(SD,n= 3)Fig.2 Changes in soil substrate-induced respiration of rice straw after inoculated withArbuscular mycorrhizalfungi

2.4 接種AM真菌對土壤胞外酶活性的影響

土壤胞外酶直接參與了土壤營養(yǎng)元素的有效化過程，是土壤中有機質(zhì)分解的主要介質(zhì)，其活性在一定程度上反映了微生物的代謝速率和土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的動態(tài)進(jìn)程。經(jīng)過7個月的分解實驗，與對照相比，各接菌處理下與碳素分解相關(guān)的纖維素酶、與氮素分解相關(guān)的蛋白酶和硝酸還原酶以及與磷素轉(zhuǎn)化相關(guān)的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均表現(xiàn)出上升趨勢。

纖維二糖水解酶和脲酶變化不顯著(圖3a, b)。

蛋白酶是氮素水解酶類的一種，參與將土壤有機質(zhì)中的蛋白質(zhì)、肽類分解為氨基酸，為植物提供氮源。如圖3a所示，蛋白酶活性總體表現(xiàn)為接菌處理大于對照處理，GM處理下活性最強(1.64 IU)，顯著高于對照9.3 %。說明接種摩西球囊霉菌能促進(jìn)蛋白酶的分泌，進(jìn)而可能加快稻稈中含氮有機化合物的水解。

硝酸還原酶是氮素代謝中的關(guān)鍵酶之一，它的活性高低直接影響到植物對土壤中硝態(tài)氮素的利用，進(jìn)而影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。圖3b顯示，GM和GE接種處理后的土壤硝酸還原酶活性均顯著高于對照和GI處理(P< 0.05)。因此可能摩西球囊霉菌和幼套球囊霉在對稻稈氮素分解過程中的硝態(tài)氮素的礦化方面比根內(nèi)球囊霉更有優(yōu)勢。

磷酸酶主要在有機磷向無機磷礦化的過程中發(fā)揮重要作用。由圖3b可知，GM處理顯著提高了土壤酸性磷酸酶的活性(10.55 %)。與對照相比，GM和GI兩種處理下堿性磷酸酶的活性分別增加了18.35 %和14.93 %。GM處理下酸性和堿性磷酸酶的活性均有所下降。此外堿性磷酸酶與酸性磷酸酶的比值(ALP/ACP)是反應(yīng)微生物分解功能群類型的敏感指示劑[20]。GM和GI接菌處理顯著提高了土壤ALP/ACP比值，這表明稻稈分解土壤微生物對摩西球囊霉菌和根內(nèi)球囊霉菌株的協(xié)作調(diào)控反應(yīng)較敏感，微生物功能群變化較大。

2.5 土壤酶活性和微生物量間的相關(guān)性

從表2可以看出，除酸性磷酸酶外，土壤微生物呼吸量和各種酶活之間均有顯著相關(guān)關(guān)系。各種土壤酶活性之間，纖維素酶與纖維二糖糖水解酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶，脲酶與纖維二糖水解酶、硝酸還原酶、蛋白酶、酸性磷酸酶以及堿性磷酸酶與硝酸還原酶、蛋白酶之間均顯著相關(guān)性；而且堿性磷酸酶與土壤微生物呼吸、蛋白酶與硝酸還原酶之間的相關(guān)性極顯著(表2)。

CMC表示纖維素酶；PNC表示纖維二糖水解酶；PR表示蛋白酶；UR表示脲酶；NR表示硝酸還原酶；ACP表示酸性磷酸酶；ALP表示堿性磷酸酶；ALP/ACP表示堿性磷酸酶與酸性磷酸酶比值 Abbreviations: CMC, cellulase; PNC, cellobiohydrolase; PR, protease; UR, urease; NR, nitrate reductase; ACP, acid phosphatase; ALP, alkaline phosphatase; ALP/ACP, ratio of alkaline phosphatase to acid phosphatase圖3 接種叢枝菌根真菌后稻稈周圍土壤酶活性變化(SD,n= 3，數(shù)值為7個月的平均值)Fig.3 Changes in soil enzyme activities of rice straw after being inoculated withArbuscular mycorrhizalfungi

表2 土壤微生物量和土壤酶活性間的相關(guān)關(guān)系

注：*和**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。

Note: * and ** show significant differences at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

3 討 論

本試驗采用網(wǎng)袋法研究了接種3種AM真菌G.mosseae、根內(nèi)球囊霉G.intraradices和幼套球囊霉G.etunicatum對水稻秸稈分解的影響。在同一宿主植物小麥的前提下，通過測定稻稈分解速率、土壤酶活性和微生物呼吸量的動態(tài)變化，明確了AM真菌對水稻秸稈分解的作用。研究結(jié)果接種摩西球囊霉菌和根內(nèi)球囊霉菌能夠顯著促進(jìn)稻稈的分解。雖然幼套球囊霉菌的促進(jìn)作用不顯著，但并未抑制稻稈的分解。已有的研究也發(fā)現(xiàn)AM菌侵染宿主形成共生體后，會引起植物殘體降解速率發(fā)生變化[21-22]。在本研究為期7個月的試驗過程中，接種摩西球囊霉菌的降解速率均高于根內(nèi)球囊霉菌和幼套球囊霉菌接種處理，在一定程度上說明摩西球囊霉菌在促進(jìn)水稻秸稈降解過程中的作用更顯著。

理論上認(rèn)為，AM真菌能夠影響植物根際土壤微生物區(qū)系及土壤養(yǎng)分含量，從而影響凋落物的分解。Nuccio等的研究報道，AM真菌主要通過氮輸出對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控，約10 %的細(xì)菌群落、放線菌群落對AM真菌做出積極響應(yīng)[23]。但也有數(shù)據(jù)顯示在凋落物分解后期(180 d)，AM真菌與土壤微生物群落相互競爭養(yǎng)分，抑制土壤中真菌和細(xì)菌類群的生長[22]。Jannoura等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)對土壤微生物的氮素供應(yīng)不足時，豌豆菌根真菌對玉米秸稈的分解作用顯著降低[24]。課題組的最新研究也表明AM真菌對凋落物分解的促進(jìn)作用與所在土壤的養(yǎng)分含量有關(guān)，在中等營養(yǎng)土壤環(huán)境中接種叢枝菌根真菌能夠調(diào)動凋落物中氮素的礦化，加快分解[11]。本研究中接種AM真菌處理的土壤微生物呼吸量普遍顯著增加，可能盆栽小麥的適時追肥保證了土壤中足夠的養(yǎng)分供給，使得AM真菌與土壤微生物分解功能群之間協(xié)調(diào)生長，減少了AM真菌與分解微生物對土壤養(yǎng)分的競爭。

土壤酶是土壤系統(tǒng)生化反應(yīng)大小和方向的調(diào)控者，參與土壤中有機物質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)化，影響土壤中的各種代謝過程[25]。土壤酶主要來自土壤微生物的代謝，還有部分來自動植物分泌[26-27]。由于AM真菌不能像腐生微生物群一樣直接分泌胞外酶，菌絲單獨存在時并不能礦化土壤中的凋落物[28]；但AM真菌能夠促進(jìn)土壤中多種酶類的分泌，增強多種土壤酶的活性，如β-葡萄糖苷酶[29]、堿性磷酸酶[30-31]、過氧化氫酶[9]、脲酶[31]和硝酸還原酶[11]，可能對植物殘體的降解產(chǎn)生作用[32]。本研究中接種AM真菌顯著促進(jìn)了與碳、氮和磷分解相關(guān)的纖維素酶、蛋白酶、硝酸還原酶、酸性磷酸酶以及堿性磷酸酶的活性，故而本研究中AM真菌促進(jìn)稻稈分解，除了對分解微生物群的調(diào)控作用，還可能通過增加參與稻稈分解過程中的各種土壤的酶活性來促進(jìn)有機質(zhì)的分解。研究中各種酶活性的顯著提高對解釋接種AM真菌提高稻稈的分解速率也提供了依據(jù)。

綜上分析，本研究發(fā)現(xiàn)AM真菌可能通過提高土壤分解微生物群系的生物量，以及提高蛋白酶、硝酸還原酶和磷酸酶的活性，直接或間接的參與催化水稻秸稈的礦化過程，促進(jìn)稻稈的分解。而且接種摩西球囊霉菌對加快稻稈分解速率、提高土壤酶活性明顯優(yōu)于另外兩種菌根真菌。因此，在下一步將AM真菌應(yīng)用于稻田實踐的試驗中，摩西球囊霉菌可作為有效篩選菌種之一，以促進(jìn)稻田有機質(zhì)的養(yǎng)分循環(huán)，獲得更高的應(yīng)用價值。