張冬英，梁青青，劉 帆，伍 欣，張肖娟，余澤恩，黃業(yè)偉*

(1.普洱茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201)

【研究意義】茶是最受人們歡迎的健康飲料之一，茶葉中含有茶多酚、茶多糖、咖啡因等多種功效成分,具有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗菌和抗輻射等多種生理功能[1]，紅茶約占所有茶葉消費(fèi)量的80 %，是最主要的茶類之一[2]。紅茶富含咖啡因、茶氨酸、維生素A等多種營養(yǎng)元素，茶紅素和茶黃素等色素新成分增多，使得紅茶干茶呈現(xiàn)烏黑潤澤的色澤，紅茶沖泡具有紅茶紅湯、經(jīng)久耐泡以及滋味醇厚等特征[3]。已有研究表明，紅茶具有改善高脂飲食小鼠所引起高血脂以及肝損傷的作用[4]；能夠改善去卵巢誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松[5]；還能夠有效的預(yù)防抗生素所誘導(dǎo)的小鼠的腸道菌群失衡[6]，紅茶提取物也能夠抑制胃癌細(xì)胞的生長[7]。正是由于紅茶有益于人類的健康，其受到越來越多的人喜歡。然而，眾所周知紅茶中含有大量的咖啡因，其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮劑，也是紅茶中滋味苦澀的因素之一，具有明顯的興奮效應(yīng)[8]。正是由于紅茶中富含影響睡眠的物質(zhì)咖啡因，很多消費(fèi)者考慮到其有著影響睡眠的副作用，進(jìn)而限制了紅茶的飲用時(shí)間以及飲用量?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】氨基酸是紅茶中的主要化學(xué)成分之一，紅茶中含有的氨基酸主要有茶氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)等多種氨基酸[9]，這3種氨基酸在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化，其中茶氨酸和GABA均具有安靜、促進(jìn)睡眠、增強(qiáng)記憶等功效。已有研究表明，茶氨酸有促進(jìn)睡眠和增強(qiáng)大腦功能和降血壓的效果。主要氨基酸(GABA、茶氨酸以及谷氨酸)含量較高的紅茶對(duì)小鼠具有明顯的鎮(zhèn)靜作用[10]。關(guān)于紅茶成分分析和功效研究的文獻(xiàn)較多，有關(guān)紅茶中主要影響睡眠成分的溶出規(guī)律研究鮮見報(bào)道。這些具有不同理化性質(zhì)的生理活性物質(zhì)，其水溶性也有較大差異。日常飲茶的沖泡條件和方式影響紅茶主要品質(zhì)成分的溶出，從而導(dǎo)致茶湯滋味和香氣等品質(zhì)特征以及飲茶功效的差異[11-12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)以紅茶為試樣，依據(jù)人們?nèi)粘_泡紅茶的一些習(xí)慣(如溫度、時(shí)間、茶水比)，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和HPLC法研究紅茶中主要影響睡眠成分的溶出特點(diǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】使人們依據(jù)不同的飲茶需要和預(yù)期效果(避免飲茶影響睡眠或者需要飲茶以振奮精神等)，通過選擇特定的沖泡條件實(shí)現(xiàn)對(duì)不同品質(zhì)成分?jǐn)z入的控制。研究結(jié)果能夠?yàn)槿藗兒侠磉x擇紅茶的沖泡條件提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

工夫紅茶(一級(jí)，由陜西安康漢水韻茶葉有限公司提供)；茶氨酸、谷氨酸、GABA和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98 %，阿拉丁)；乙腈(色譜純，默克化工技術(shù)(上海)有限公司)；醋酸鈉(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；磷酸(色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司)；甲醇(色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(安捷倫1260)；Agilent ZORBAX Eclipse AAA-C18柱(5 μm 4.6 mm×150 mm，P.N. 993400-902)；超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司SK-18TC)；低速離心機(jī)(中佳SC-3616)；移液器；0.45 μm過濾器等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢測樣品的準(zhǔn)備 結(jié)合人們泡茶的習(xí)慣，針對(duì)溫度( ℃)、時(shí)間(min)和茶水比(g/mL)3個(gè)因素分別設(shè)置3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，每個(gè)處理重復(fù)3次。精密稱量2.00 g紅茶樣品，在特定的條件下沖泡，過濾得到茶湯，待測。

1.3.2 氨基酸的HPLC檢測方法 以乙腈(7 %)和90 mmol/L醋酸鈉(93 %)為流動(dòng)相A(混勻后調(diào)pH值至6.5)，B相為80 %乙腈，梯度洗脫(程序見表2)；柱溫為40 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為14 μl；檢測時(shí)間為25.5 min，檢測器設(shè)置激發(fā)波長為230 nm，發(fā)射波長為450 nm[13]。

柱前衍生反應(yīng)過程如下：用0.5 mL甲醇充分溶解10 mg OPA，加入β-巰基乙醇(30 μl)，震蕩使其均勻之后過濾備用。并配制硼酸鹽緩沖溶液(0.4 mol/L，pH 10.4)，混勻、過濾后備用。進(jìn)樣程序：抽取硼酸鹽緩沖溶液(10 μl)→洗針→吸取OPA衍生試劑(2 μl)→洗針→吸取樣品(2 μl)→洗針→混合→進(jìn)樣→洗針。

1.3.3 咖啡因的HPLC檢測方法 以5 %的乙腈(配制方法：2842.17 mL水 + 150 mL乙腈 + 9.21 mL磷酸)為流動(dòng)相A，80 %的乙腈(配制方法：296.085 mL 水 + 1200 mL乙腈 + 4.605 mL磷酸)為流動(dòng)相B；進(jìn)樣量為10.0 μl；流速為0.70 mL/min；柱溫為40 ℃；紫外檢測器檢測波長為280 nm，按照表3所示的梯度洗脫程序進(jìn)行檢測。

表1 不同沖泡條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

注：昆明地區(qū)水的沸點(diǎn)約為93.5 ℃。

Note: The boiling point of water was about 93.5 ℃.

表2 梯度洗脫程序

表3 梯度洗脫程序

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測氨基酸，咖啡因的校正曲線

校正曲線的繪制：分別精確配制相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)品質(zhì)量濃度x對(duì)峰面積y求出相應(yīng)的線性回歸方程，并繪制校正曲線，結(jié)果如圖1所示。

咖啡因(A)、茶氨酸(B)、谷氨酸(C)以及GABA(D)在色譜條件下的保留時(shí)間分別為22.507、13.993、2.821以及22.507 min，線性回歸方程分別為：y=54609.1771x+360.79718、y=26.2531337x+6.3136924、y=44.6905139x+17.278935以及y=89.1198907x-23.720444，相關(guān)系數(shù)分別為0.99983、0.99742、0.99886以及0.99815。在合理的范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可作為精確定量分析方法。

圖1 HPLC檢測咖啡因(A)、茶氨酸(B)、谷氨酸(C)、GABA(D)的校正曲線Fig.1 HPLC detection of caffeine, theanine, glutamic, GABA calibration curve

表4 咖啡因和氨基酸的含量

2.2 紅茶中影響睡眠的主要品質(zhì)成分的含量

以紅茶為試樣，應(yīng)用HPLC法檢測其主要品質(zhì)成分(茶氨酸、谷氨酸、GABA以及咖啡因)的含量，根據(jù)上述已得標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相關(guān)樣品含量的計(jì)算，成分含量結(jié)果如表4所示。

由表5可知，紅茶中咖啡因的含量為4.4 %左右，而茶氨酸含量約為1.4 %，谷氨酸含量約為0.2 %。此外，GABA的含量僅達(dá)0.07 %，考慮到其含量較低，且其可以與茶氨酸和谷氨酸3者相互轉(zhuǎn)化，在后續(xù)溶出規(guī)律的研究中筆者只對(duì)茶氨酸和谷氨酸進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.3 沖泡條件對(duì)紅茶中咖啡因溶出的影響

咖啡因是是組成茶葉滋味的重要物質(zhì)，是茶葉苦味的主要來源之一。根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)紅茶在不同沖泡條件下咖啡因的溶出率進(jìn)行了檢測和分析，結(jié)果如圖2和表6所示。

由圖2可知，以70 ℃的水溫沖泡2 min時(shí)，僅有12.5 %的咖啡因溶出。沖泡溫度越高、時(shí)間越長，咖啡因的溶出越多。以93.5 ℃沖泡10 min時(shí)，紅茶中約44.3 %的咖啡因溶解到茶湯中。

圖2 不同沖泡條件下紅茶中咖啡因的溶出率Fig.2 Dissolution rate of caffeine in black tea with different tea brewing condition

由表5可知，茶水比、時(shí)間和水溫均可顯著影(P<0.01)響工夫紅茶中咖啡因的溶出。相比之下，時(shí)間對(duì)工夫紅茶中咖啡因的溶出率影響最為顯著，水溫次之，茶水比的影響相對(duì)較小。

2.4 沖泡條件對(duì)紅茶中茶氨酸和谷氨酸溶出的影響

氨基酸是茶葉中生津潤甜的主要成份，是組成茶葉品質(zhì)特征的成分之一。茶氨酸和谷氨酸作為紅茶中含量較高的氨基酸，在不同沖泡條件下的溶出率如圖3和表6所示。

表5 咖啡因溶出率的方差分析

圖3 不同沖泡條件下紅茶茶氨酸和谷氨酸的溶出率Fig.3 Dissolution rate of theanine and glutamate in black tea with different tea brewing condition

表6 茶氨酸和谷氨酸溶出率的方差分析

由圖3可以看出，不同沖泡條件下，紅茶中茶氨酸(A)和谷氨酸(B)的溶出率大致相同，具有相類似的變化趨勢(shì)。當(dāng)水溫為70 ℃、沖泡時(shí)間為2 min時(shí)，茶氨酸和谷氨酸的溶出率均達(dá)到40 %左右，相比于咖啡因，紅茶中茶氨酸和谷氨酸的溶出相對(duì)較快。當(dāng)水溫為93.5 ℃、沖泡時(shí)間為10 min時(shí)，茶氨酸和谷氨酸的溶出率均達(dá)到80 %以上，達(dá)到了咖啡因溶出率的2倍。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在只沖泡1次的條件下，茶氨酸和谷氨酸溶出量隨著沖泡時(shí)間的延長而逐漸增多；沖泡溫度的提高，亦可顯著促進(jìn)氨基酸的溶出。

由表6可知，茶水比、時(shí)間和水溫均可顯著影響茶氨酸和谷氨酸的溶出(P<0.01)，不同因素的影響程度差異也較為顯著。這3個(gè)因素對(duì)茶氨酸和谷氨酸溶出率影響的大小依次為時(shí)間>水溫>茶水比。

2.5 紅茶中影響睡眠的主要品質(zhì)成分溶出率的比較

為了更為全面地分析紅茶中咖啡因和氨基酸溶出情況的差異，選擇沖泡溫度最低、時(shí)間最短的條件“1”和沖泡溫度最高、時(shí)間最長的條件“9”進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，沖泡條件不同，各品質(zhì)成分的溶出率差異較大。在沖泡條件1下(A)，茶氨酸和谷氨酸的溶出率相當(dāng)，約為40 %；咖啡因的溶出率較低，僅達(dá)到12.5 %。在沖泡條件9下(B)，茶氨酸和谷氨酸的溶出率相當(dāng)(超過80 %)；咖啡因的溶出率約為氨基酸的一半(約40 %)。因此，相同沖泡條件下，氨基酸的溶出速度顯著高于咖啡因。為了進(jìn)一步確定有利于促進(jìn)氨基酸、抑制咖啡因溶出的沖泡條件，以茶氨酸為例對(duì)不同沖泡條件下氨基酸溶出率和咖啡因溶出率之比進(jìn)行了比較分析，結(jié)果如圖5所示。

方差分析結(jié)果如圖5所示，在沖泡條件1和沖泡條件4下，茶氨酸溶出率和咖啡因溶出率之比沒有顯著性差異(P>0.05)，但在這2種沖泡條件下的茶氨酸和咖啡因溶出率之比均顯著高于其他沖泡條件(P<0.001)。以上結(jié)果說明沖泡時(shí)間為2 min，沖泡水溫分別為70和80 ℃時(shí)，2種成分溶出率之比沒有顯著性差異，而90 ℃的水溫顯著降低了茶氨酸和咖啡因溶出率之比。故在沖泡紅茶時(shí)，為了更好地利用其中的茶氨酸、避開咖啡因，沖泡水溫應(yīng)控制在80 ℃以內(nèi)。

圖4 主要品質(zhì)成分溶出率的比較Fig.4 Comparison of dissolution rate of the main quality components

“***”表示與沖泡條件1相比差異極顯著，P<0.001；“###”表示與沖泡條件4相比差異極顯著，P<0.001‘***’ meant very significant difference when compared with brewing condition 1(P<0.001),‘###’ meant very significant difference when compared with brewing condition 4(P<0.001)圖5 茶氨酸和咖啡因的溶出率之比Fig.5 The ratio of the dissolution rate of theanine to caffeine

3 討 論

3.1 關(guān)于紅茶

茶是一種健康的飲品，具有提神、補(bǔ)充微量元素、抗衰老等作用[14]，而紅茶是最受消費(fèi)者喜愛的茶飲品之一。紅茶中含有豐富的氨基酸、多酚、咖啡因等物質(zhì)。其中氨基酸是主要的含氮物質(zhì)，具有良好的鎮(zhèn)靜效果，也是合成許多與代謝產(chǎn)物有關(guān)的生理活性物質(zhì)的先質(zhì)[15]。茶氨酸和谷氨酸是存在于紅茶中的游離氨基酸，為主要呈味物質(zhì)。GABA是一種非蛋白質(zhì)天然氨基酸，具有良好的保健功效[18]。紅茶中谷氨酸可以轉(zhuǎn)化為茶氨酸和GABA?？Х纫蚴且环N黃嘌呤生物堿化合物，是一種中樞神經(jīng)興奮劑，也是茶葉中滋味苦澀的因素之一。

3.2 關(guān)于紅茶中主要影響睡眠的成分

已有研究表明，茶氨酸和谷氨酸具有安神、降血壓、抗腫瘤、提高記憶力和保護(hù)神經(jīng)等多種生理功能，在食品與保健品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[16-17]?？Х纫蚓哂信d奮神經(jīng)中樞、消除疲勞、抗憂郁、控制體重、促進(jìn)消化、改善便秘、利尿、止痛、保護(hù)心臟血管等功能[19-21]。試驗(yàn)中所檢測的茶樣中GABA的含量相對(duì)較低，這可能與所選用紅茶的制茶工藝有關(guān)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)進(jìn)一步研究與安神、助眠有關(guān)的生理活性物質(zhì)茶氨酸和谷氨酸以及與影響睡眠有關(guān)的咖啡因的溶出規(guī)律。

3.3 關(guān)于茶氨酸、谷氨酸、咖啡因的溶出規(guī)律

氨基酸和咖啡因的溶出量隨著沖泡時(shí)間的延長而逐漸增多；沖泡溫度越高，紅茶中可溶性物質(zhì)溶出量越多。其中，沖泡時(shí)間是影響紅茶中主要品質(zhì)成分溶出的主要因素，時(shí)間越長，可溶性物質(zhì)越容易溶出；除此之外，沖泡溫度也是影響主要品質(zhì)成分溶出的因素，溫度越高，分子越活躍，運(yùn)動(dòng)速度越快，加快了可溶性物質(zhì)的溶出。茶水比對(duì)主要品質(zhì)成分溶出的影響最小。此外，與咖啡因相比，氨基酸的溶出在相同條件下更多。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果可為消費(fèi)者科學(xué)飲用紅茶提供理論參考，以便根據(jù)不同需求選擇相應(yīng)的沖泡條件。如需要提神醒腦，可選擇高水溫、長時(shí)間的條件沖泡紅茶，使咖啡因充分溶解出來，從而達(dá)到興奮神經(jīng)中樞、消除疲勞、提神的目的。如需要通過飲茶達(dá)到保護(hù)神經(jīng)、緩解壓力、改善睡眠和抗焦慮的功效或者睡前飲用紅茶，可選擇在較低水溫、短時(shí)間的條件下沖泡紅茶，此時(shí)咖啡因的溶出量較低，茶氨酸和谷氨酸的溶出量較高，以發(fā)揮茶氨酸安神、改善睡眠的功效。對(duì)紅茶中主要品質(zhì)成分溶出規(guī)律的闡明有助于充分、合理利用紅茶的功能成分和保健價(jià)值，有利于消費(fèi)者根據(jù)自身需求科學(xué)飲用紅茶。