王 煜，肖 楊，熊正偉，唐 雪，唐小燕，胡 莉

(1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；2.四川師范大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究室，四川 成都 610101)

【研究意義】外來(lái)入侵植物加拿大蓬(Erigeroncanadensis)[1]對(duì)周圍農(nóng)作物生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)已經(jīng)引起了研究者們的廣泛重視[2-4]。如2003年Shaukat等[5]發(fā)現(xiàn)加拿大蓬不同濃度水浸提液可顯著抑制番茄(LycopersiconesculentumMill.)、蘿卜(RaphanussativusL.)玉米(ZeawaysL.)等6種作物種子的萌發(fā)及其根、芽的生長(zhǎng)。高興祥等[6]于2010年證實(shí)加拿大蓬全株水浸提物、莖葉淋溶物、根系分泌物及殘?bào)w土壤分解物等均可顯著抑制多種受體植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。楊莉等[7]發(fā)現(xiàn)多種作物的種子萌發(fā)和根、芽的生長(zhǎng)受到加拿大蓬揮發(fā)油經(jīng)揮發(fā)和淋溶途徑的化感脅迫作用。這些研究主要集中于對(duì)加拿大蓬的對(duì)受體物種植株水平上不同化感脅迫效應(yīng)的現(xiàn)象揭示，但就該現(xiàn)象的本質(zhì)及其在細(xì)胞水平、分子水平上作用機(jī)制的研究卻罕有報(bào)道?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】本研究室張紅等[8]的前期研究發(fā)現(xiàn)，加拿大蓬揮發(fā)油經(jīng)空氣和土壤載體均可使蠶豆(VaciafabaL.)根尖細(xì)胞產(chǎn)生多種類型的染色體畸變，誘導(dǎo)微核產(chǎn)生，顯著抑制了幼根的生長(zhǎng)。其后的相關(guān)研究表明[9]，加拿大蓬揮發(fā)油可誘導(dǎo)受體植物根邊緣細(xì)胞死亡，從而抑制了受體植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育。此外，植物葉片下表皮的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞也能對(duì)環(huán)境脅迫做出極為靈敏的反應(yīng)[10]，可以用于評(píng)價(jià)環(huán)境毒物對(duì)細(xì)胞的致死、致突變、致畸形等效應(yīng)[11-13],是研究外來(lái)入侵植物產(chǎn)生的化感物質(zhì)作用機(jī)制的良好材料。【本研究切入點(diǎn)】目前，加拿大蓬揮發(fā)油通過(guò)揮發(fā)、淋溶途徑對(duì)周圍受體植物氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的毒性作用尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】因此，本文擬采用受到加拿大蓬入侵危害的作物豌豆(Pisumsativum)葉片下表皮保衛(wèi)細(xì)胞為受體材料，模擬揮發(fā)和淋溶兩途徑研究了加拿大蓬揮發(fā)油的毒性效應(yīng)，并用多種抑制劑進(jìn)行干擾處理，旨在明確加拿大蓬揮發(fā)油通過(guò)不同途徑對(duì)豌豆保衛(wèi)細(xì)胞的遺傳毒害和致死效應(yīng)，以期為揭示其入侵的分子機(jī)制提供相應(yīng)的理論依據(jù)，并可為加拿大蓬的有效防治以及合理開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

加拿大蓬采自四川師范大學(xué)成龍校區(qū)內(nèi)，豌豆種子為市售。

泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK及6種干擾劑均產(chǎn)自Beyotime生化試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 材料的培養(yǎng)和準(zhǔn)備 采用水蒸氣蒸餾法[]提取加拿大蓬揮發(fā)油，所提取的揮發(fā)油為淺黃色透明液體，有刺鼻性氣味，收集到的揮發(fā)油用無(wú)水硫酸鈉干燥后得液體揮發(fā)油，使用二甲基亞砜(DMSO)為助溶劑，配制成10 %的揮發(fā)油母液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

挑選顆粒飽滿、無(wú)損傷的豌豆種子，蒸餾水漂洗3次，0.5 % KMnO4消毒8 min，蒸餾水洗凈，25 ℃暗培養(yǎng)24 h，換濕紗布包裹催芽2～3 d。選取萌發(fā)狀況一致的種子均勻種植于盛有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中(直徑14 cm，高度12 cm)，每隔3 d澆1次水。3～4周取平展葉片用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 脅迫處理 挑選高度一致、葉片大小均勻、長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)損傷的豌豆苗，從豌豆苗頂端取完全伸展開(kāi)的葉片，用鑷子在葉片上撕取長(zhǎng)1～1.5 cm，寬0.5～1.0 cm的表皮條放入加有5 mL MES緩沖液[12]的EP管中。① 模擬揮發(fā)途徑的化感脅迫處理：將表皮條平鋪于濾紙條(8 cm × 0.9 cm)上，放入加有1 mL MES緩沖液的10 mL EP管內(nèi)，使濾紙條浸于MES緩沖液中，分別在EP管蓋上均勻涂抹揮發(fā)油母液1、2、4、8、16 μl，以僅MES緩沖液處理為CK，25 ℃光照培養(yǎng)箱中處理0.5 h，重復(fù)3次;② 模擬淋溶途徑的化感脅迫處理:分別取揮發(fā)油母液1、2、4、8、16 μl(記為梯度1、2、3、4、5)，DMSO補(bǔ)至16 μl后加入EP管中，25 ℃光照0.5 h，以僅MES緩沖液(CK1)和MES緩沖液加16 μl DMSO處理(CK2)為對(duì)照，重復(fù)3次。

1.2.3 緩解處理 在1.2.2的EP管中分別加入下列干擾劑：抗氧化劑AsA(0.5 mmol/L)100、200、400 μl，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)清除劑CAT(500 U/mL)20、40、80 μl，Ca2+螯合劑EGTA(0.5 mmol/L)40、80、160 μl，Ca2+通道抑制劑LaCl3(0.5 mmol/L)20、40、80 μl，硝酸還原酶(Nitrate reductase，NR)抑制劑NaN3(0.5 mmol/L)20、40、80 μl，一氧化氮合酶(Nitric oxide synthetase，NOS)抑制劑L-NAME(0.5 mmol/L)15、30、45 μl，泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK(0.1 μmol/L)10、20、40 μl，預(yù)處理10 min后分別按① 和② 加入8 μl揮發(fā)油母液，以只加MES緩沖液(CK1)和MES緩沖液附加8 μl揮發(fā)油母液(CK2)為對(duì)照，重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞核形態(tài)和細(xì)胞活性檢測(cè) 核形態(tài)檢測(cè)：表皮條經(jīng)MES緩沖液清洗后，卡諾氏液固定2 h，1 mol/L鹽酸60 ℃解離8 min，蒸餾水洗3次，Schiff試劑避光染色1 h，LEICA DM300顯微鏡下觀察拍照。每處理至少觀察1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算核異常率。

細(xì)胞活性檢測(cè)：采用馬丹煒等[15]的方法稍有改進(jìn)。表皮條經(jīng)MES緩沖液洗3次后鋪于載玻片上，AO/EB避光染色3 min，LEICA DM300熒光顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)公司)觀察拍照。具亮紅色熒光為死細(xì)胞，綠色熒光為活細(xì)胞。每處理至少觀察1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算死亡率。

a:正?；罴?xì)胞；b:單保衛(wèi)細(xì)胞失活；c:雙保衛(wèi)細(xì)胞失活；d:核斷裂和畸形；e:核固縮、遷移和畸形；f:核斷裂和消失a: Normal living cells; b: Single guard cell inactivation; c: Double guard cell inactivation; d: Nuclear fracture and deformity; e: Nuclear condensation, migration and deformity; f: Nuclear breakage and disappearance圖1 加拿大蓬揮發(fā)油處理后豌豆保衛(wèi)細(xì)胞活性變化Fig.1 Viability changes in the guard cells ofPisum sativumexposed to volatile oil fromErigeron canadensis

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)錄入和作圖采用Microsoft Excel 2010，SPSS 20.00統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、Duncan法比較均值，獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)結(jié)合隸屬函數(shù)法[16]比較兩條途徑下?lián)]發(fā)油毒性效應(yīng)的強(qiáng)度。隸屬函數(shù)計(jì)算公式為：

物流設(shè)施主要就是指為了能夠更好的開(kāi)展物流工作而設(shè)置的系統(tǒng)以及組織等，其主要包括了物流信息管理系統(tǒng)、配送系統(tǒng)以及自動(dòng)化立體倉(cāng)庫(kù)等諸多基礎(chǔ)設(shè)施，在物流行業(yè)中占據(jù)著十分重要的地位。物流設(shè)備主要就是指為了能夠滿足物流生產(chǎn)作業(yè)而形成的必要操作工具，主要包括了搬運(yùn)車、貨架、升降機(jī)以及集裝輔助件等諸多設(shè)備。

式中，U(Xi)為某處理下某指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xi為某處理水平的某指標(biāo)測(cè)定值；Xmin和Xmax分別為所有參試系中該指標(biāo)的最小值和最大值。先求出不同揮發(fā)油劑量處理下的各指標(biāo)隸屬函數(shù)值后，求得每一指標(biāo)的隸屬函數(shù)均值，最后得出不同途徑中各指標(biāo)隸屬函數(shù)的總平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 加拿大蓬揮發(fā)油通過(guò)不同途徑對(duì)豌豆保衛(wèi)細(xì)胞活性的影響

經(jīng)AO/EB染色后，在熒光顯微鏡下，對(duì)照組豌豆保衛(wèi)細(xì)胞大都能觀察到亮綠色存活狀態(tài)的細(xì)胞核(圖1a)，也有較少的保衛(wèi)細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)死細(xì)胞的亮紅色熒光。無(wú)論揮發(fā)途徑還是淋溶途徑，處理組中均有較多紅色熒光的死亡細(xì)胞核(圖1b-f)，其數(shù)量具有隨揮發(fā)油處理劑量增加而上升的趨勢(shì)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核形態(tài)的大量畸變，如核畸形(圖1d-e)、核固縮和核遷移(圖1e)、核斷裂(圖1d，f)，甚至核降解消失(圖1f)等。其中細(xì)胞核固縮、斷裂、降解和消失等現(xiàn)象是植物細(xì)胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)的特征之一。這表明加拿大蓬揮發(fā)油經(jīng)不同途徑對(duì)豌豆保衛(wèi)細(xì)胞均具有明顯的細(xì)胞毒性，可誘導(dǎo)豌豆保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)生核形態(tài)的大量畸變，誘發(fā)細(xì)胞死亡，推測(cè)這種細(xì)胞死亡方式屬于程序性細(xì)胞死亡。

與對(duì)照組相比，加拿大蓬揮發(fā)油經(jīng)不同途徑處理保衛(wèi)細(xì)胞后，其死亡率均顯著增加(P<0.05，表1)，并隨著揮發(fā)油處理劑量的增加而顯著升高(Pearson揮發(fā)=0.924，Pearson淋溶=0.882，P<0.01)。當(dāng)揮發(fā)油劑量為16 μl時(shí)，經(jīng)揮發(fā)途徑處理后保衛(wèi)細(xì)胞死亡率高達(dá)81.556 %，約為對(duì)照組的6倍；經(jīng)淋溶途徑處理的細(xì)胞死亡率高于揮發(fā)途徑，達(dá)83.518 %。由此可見(jiàn)，加拿大蓬揮發(fā)油經(jīng)揮發(fā)和淋溶途徑均可對(duì)豌豆保衛(wèi)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞死亡，并且具有劑量依賴效應(yīng)。

當(dāng)處理劑量相同時(shí)，加拿大蓬揮發(fā)油通過(guò)淋溶途徑處理組的死亡率均顯著高于揮發(fā)途徑處理組(P<0.05，表1)。同時(shí)，淋溶途徑處理下細(xì)胞死亡率的隸屬函數(shù)均值為0.600，高于揮發(fā)途徑的0.472。由此可見(jiàn)，在該模擬實(shí)驗(yàn)條件下，加拿大蓬揮發(fā)油經(jīng)淋溶途徑處理對(duì)豌豆保衛(wèi)細(xì)胞的脅迫致死效應(yīng)大于揮發(fā)途徑。

2.2 加拿大蓬揮發(fā)油通過(guò)不同途徑對(duì)豌豆保衛(wèi)細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)的影響

在光學(xué)顯微鏡下觀察Schiff試劑染色后的豌豆保衛(wèi)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中正常細(xì)胞核為著色較深的半月形，形態(tài)規(guī)則，左右對(duì)稱，位于保衛(wèi)細(xì)胞中央(圖2a)。揮發(fā)油通過(guò)不同途徑處理后，豌豆保衛(wèi)細(xì)胞的核形態(tài)常出現(xiàn)各種畸變，如核遷移(圖2b，d)、核固縮(圖2c，d，f)、核畸形(圖2b)、核降解消失(圖2d，e)等，且核畸變的發(fā)生率具有隨著揮發(fā)油處理劑量增加而升高的趨勢(shì)。

表1 加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)豌豆保衛(wèi)細(xì)胞活性和核形態(tài)的影響

注：小寫字母表示同一途徑不同劑量間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；*表示揮發(fā)油劑量相同時(shí)，淋溶途徑與揮發(fā)途徑處理有顯著差異，P<0.05，下同。

Note: Lowercase letters indicate statistical differences between different doses of the same pathway; * indicates significant difference between the eluviation and volatilization treatment when the volatile oil dose is the same,P<0.05, the same as below.

表1數(shù)據(jù)顯示，加拿大蓬揮發(fā)油經(jīng)2種途徑處理均可導(dǎo)致豌豆保衛(wèi)細(xì)胞核畸變率顯著升高(P<0.05)，并隨著處理劑量增加呈先升高再降低的趨勢(shì)，細(xì)胞核畸變率均在揮發(fā)油劑量為8 μl時(shí)達(dá)到最大，隨后顯著下降(P<0.05)。在低劑量時(shí)，淋溶途徑細(xì)胞核畸變率顯著高于揮發(fā)途徑，當(dāng)處理劑量分別為8和16 μl時(shí)反之(P<0.05)。由此可見(jiàn)，經(jīng)不同途徑加拿大蓬揮發(fā)油處理的豌豆保衛(wèi)細(xì)胞，無(wú)論處理劑量的多少，均可被誘導(dǎo)產(chǎn)生多種核畸變現(xiàn)象。

在劑量較低時(shí)(1、2、4 μl)，淋溶途徑處理下?lián)]發(fā)油誘導(dǎo)的蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞核畸變率顯著大于揮發(fā)途徑(P<0.05)；劑量較高時(shí)(8、16 μl)反之。綜合分析顯示，淋溶途徑處理下核畸變率的隸屬函數(shù)均值為0.351，高于揮發(fā)途徑下的0.325。這表明加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)于保衛(wèi)細(xì)胞的遺傳毒性效應(yīng)也具有淋溶途徑強(qiáng)于揮發(fā)途徑的特征。

a:CK；b：核遷移和畸形；c：核固縮和畸形；d：核遷移、固縮、降解；e：核降解消失；f：核固縮a: CK; b: Nuclear migration and aberration; c: Karyopyknosis and aberration; d: Nuclear migration, karyopyknosis and degradation; e: Nuclear degradation disappeared; f: Nuclear consolidation圖2 加拿大蓬揮發(fā)油作用下豌豆保衛(wèi)細(xì)胞核形態(tài)的變化Fig.2 Changes in the nucleus morphology of guard cells inPisum sativumexposed to volatile oil fromErigeron canadensis

表2 AsA、CAT、EGTA、LaCl3、NaN3和L-name對(duì)加拿大蓬揮發(fā)油作用下細(xì)胞死亡的緩解效應(yīng)

2.3 6種干擾劑對(duì)加拿大蓬揮發(fā)油致豌豆保衛(wèi)細(xì)胞死亡的緩解效應(yīng)

2.4 Z-VAD-FMK對(duì)加拿大蓬揮發(fā)油經(jīng)不同途徑致豌豆保衛(wèi)細(xì)胞死亡的緩解效應(yīng)

Z-VAD-FMK(benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone)是一種廣譜Caspase抑制劑，可抑制Caspase蛋白酶家族的活性，從而抑制Caspase依賴性細(xì)胞凋亡的發(fā)生[17]。經(jīng)不同劑量泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK處理后，揮發(fā)油經(jīng)不同途徑誘導(dǎo)的豌豆保衛(wèi)死亡率均隨Z-VAD-FMK處理劑量的增加而降低(表3)。在兩條途徑中細(xì)胞死亡率均在Z-VAD-FMK劑量為40 μl時(shí)達(dá)最低水平。其中，揮發(fā)途徑細(xì)胞死亡率由66.215 %下降到10.892 %，顯著低于對(duì)照(P<0.05)；淋溶途徑細(xì)胞死亡率由73.512 %減少至19.637 %，與對(duì)照接近(P>0.05)。由此可見(jiàn)，Z-VAD-FMK能顯著抑制由加拿大蓬揮發(fā)油經(jīng)不同途徑誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞死亡，推測(cè)這種細(xì)胞死亡屬于Caspase樣蛋白酶激活引起的植物PCD現(xiàn)象。

3 討 論

3.1 加拿大蓬揮發(fā)油經(jīng)不同途徑對(duì)豌豆保衛(wèi)細(xì)胞的毒性效應(yīng)

有研究表明[18-19]，入侵植物?？稍斐墒荏w植物光合器官的損傷，降低其光合效率，從而抑制受體植株的生長(zhǎng)發(fā)育。加拿大蓬也可導(dǎo)致玉米成熟植株葉面積減小，葉綠素a含量顯著降低，光合效率受到抑制[20]。結(jié)果證實(shí)，加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)受體植物葉保衛(wèi)細(xì)胞具有較強(qiáng)的遺傳致畸效應(yīng)和細(xì)胞致死效應(yīng)，與周健等[21]的研究結(jié)果一致。加拿大蓬揮發(fā)油通過(guò)揮發(fā)或淋溶途徑均可使保衛(wèi)細(xì)胞產(chǎn)生遺傳損傷，誘發(fā)Caspase依賴性細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致氣孔無(wú)法進(jìn)行閉合調(diào)節(jié)。這很可能是入侵植物揮發(fā)性化感物質(zhì)進(jìn)入受體植物，對(duì)體內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行化感攻擊的一個(gè)早期關(guān)鍵環(huán)節(jié)。推測(cè)進(jìn)入植物體內(nèi)的化感物質(zhì)也可能通過(guò)類似方式，對(duì)光合器官以及營(yíng)養(yǎng)、生殖器官造成毒性效應(yīng)，影響受體植物的生理生化機(jī)能，最終表現(xiàn)為植株水平上的生長(zhǎng)發(fā)育受阻、光合效率下降、作物產(chǎn)量降低等現(xiàn)象。

表3 泛 Caspase抑制劑對(duì)加拿大蓬揮發(fā)油作用下細(xì)胞死亡的緩解效應(yīng)

3.2 經(jīng)揮發(fā)和淋溶兩條途徑誘發(fā)的豌豆保衛(wèi)細(xì)胞毒性效應(yīng)差異

一般認(rèn)為，入侵植物釋放的揮發(fā)性化感物質(zhì)少部分通過(guò)淋溶進(jìn)入土壤影響受體植物根系[22]，大部分則通過(guò)空氣或雨霧淋溶作用于受體植物的地上器官。由于加拿大蓬揮發(fā)油的主要成分均為難溶于水的萜類化合物及其氧化物、醇類、酚類以及酮類化合物等，因此在本研究的模擬條件下，利用DMSO進(jìn)行了助溶，但數(shù)據(jù)顯示助溶劑對(duì)細(xì)胞死亡率和核畸變率的影響均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，加拿大蓬揮發(fā)油通過(guò)兩條途徑均可致使細(xì)胞活性下降，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生畸變。在同樣的處理劑量下，通過(guò)淋溶途徑作用于受體細(xì)胞時(shí)顯示出更強(qiáng)的毒性效應(yīng)(淋溶途徑和揮發(fā)途徑下隸屬函數(shù)總平均值分別為0.475和0.398)，與張紅等[8]的研究結(jié)論相似。由于不同的途徑中作用于受體植物的化感物質(zhì)有效濃度會(huì)因?qū)嶒?yàn)方法的不同而產(chǎn)生較大差異，不同受體植物對(duì)不同途徑下化感脅迫的響應(yīng)也有較大區(qū)別，因此關(guān)于化感途徑的相關(guān)研究還需要進(jìn)一步開(kāi)展下去。

3.3 ROS、NO和Ca2+參與加拿大蓬揮發(fā)油經(jīng)不同途徑對(duì)豌豆保衛(wèi)細(xì)胞的毒性效應(yīng)

前人的研究表明[23]，植物體通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控機(jī)制控制著細(xì)胞的各種生理功能，當(dāng)植物遭遇內(nèi)、外環(huán)境因子刺激時(shí)，ROS積累，作為信號(hào)分子進(jìn)行信息的傳遞，觸發(fā)不同的信號(hào)響應(yīng)途徑，可引發(fā)植物組織產(chǎn)生一系列的保護(hù)措施，如介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡等[24]。抗壞血酸(AsA)和過(guò)氧化氫酶(CAT)均能清除細(xì)胞內(nèi)多余的活性氧[25-26]，二者分別顯著緩解了加拿大揮發(fā)油經(jīng)兩種途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡，表明ROS，特別是其中的H2O2，參與了該過(guò)程的信號(hào)調(diào)控。

在植物體抵抗外界刺激時(shí)，隨著ROS的爆發(fā)，NOS活性通常也隨之增強(qiáng)，使NO迅速積累[27]。由于植物體內(nèi)的NR也是一種NOS[28]，因此，NR抑制劑NaN3和NOS抑制劑L-NAME均可抑制NO的產(chǎn)生。加拿大揮發(fā)油經(jīng)兩種途徑誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞死亡被NaN3或L-NAME顯著緩解，表明該過(guò)程不僅與ROS的積累有關(guān)，氣體信號(hào)分子NO也發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用。

王毅等[29]的研究表明，NO和ROS可通過(guò)Ca2+信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控細(xì)胞程序性死亡來(lái)抵御外界刺激，NO的含量可影響胞內(nèi)ROS和Ca2+的水平。積累的ROS可激活Ca2+通道，使胞外Ca2+內(nèi)流而導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+水平升高[30-31]。Ca2+螯合劑EGTA能夠降低細(xì)胞外Ca2+濃度從而阻止胞外Ca2+內(nèi)流，Ca2+通道抑制劑LaCl3則能夠阻止外源Ca2+進(jìn)入細(xì)胞。二者均可顯著抑制加拿大揮發(fā)油經(jīng)兩種途徑誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞死亡，說(shuō)明該過(guò)程還與胞內(nèi)Ca2+的積累有關(guān)。由此推測(cè)，加拿大蓬揮發(fā)油的細(xì)胞毒性也可能是通過(guò)NO和ROS相互作用調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的變化而引起的。

4 結(jié) 論

加拿大蓬揮發(fā)油經(jīng)揮發(fā)途徑和淋溶途徑均可誘導(dǎo)豌豆保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)生核畸變并大量死亡，且淋溶途徑的致畸致死效應(yīng)較強(qiáng)。泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK和抗氧化劑AsA、CAT，Ca2+調(diào)節(jié)劑EGTA、LaCl3，NO抑制劑NaN3和L-NAME 6種干擾劑均可有效緩解揮發(fā)油誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞死亡(P<0.05)，表明這種現(xiàn)象屬于Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡，ROS、NO和Ca2+參與了這一過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)。