陸 寬，王巧榮，霍 昕*，高玉瓊，馮發(fā)進(jìn)

(1.貴州省生物技術(shù)研究開發(fā)基地，貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴州省科暉制藥廠，貴州 貴陽(yáng) 550011)

【研究意義】農(nóng)產(chǎn)品在種植、采收以及貯藏過程中，因感染病原菌而導(dǎo)致的巨大損失已成為全球性問題。目前，在農(nóng)產(chǎn)品種植階段，主要采用化學(xué)方法控制植物病原菌的感染及擴(kuò)散。而在果蔬采后保鮮階段，控制果蔬采后病害的主要手段是冷藏結(jié)合化學(xué)抑菌劑。但化學(xué)抑菌劑對(duì)人類健康和環(huán)境的危害已成為全世界關(guān)心的問題[1]。因此，開發(fā)天然抑菌劑已成為當(dāng)前農(nóng)產(chǎn)品保鮮研究的一個(gè)熱點(diǎn)。【前人研究進(jìn)展】從中草藥中提取的精油具有良好的抑菌能力，具有較高食用安全性，被認(rèn)為是開發(fā)天然抑菌劑的重要原料[2]。肉桂是樟科屬植物肉桂的干燥樹皮，其性味辛、甘、大熱，歸腎、脾、心、肝經(jīng)，具有補(bǔ)火助陽(yáng)、引火歸源、散寒止痛和活血通經(jīng)的功效。由于其既能作為藥材使用，又能作為食物香料，是重要的藥食同源作物。肉桂具有較強(qiáng)的抑菌作用，有研究表明，肉桂精油對(duì)一些植物病原真菌及果蔬采收后的病原菌具有一定的抑制效果[3-4]。【本研究切入點(diǎn)】但關(guān)于肉桂精油對(duì)煙草赤星病菌、茄鏈格孢菌、多隔鐮刀菌、灰葡萄孢菌以及大豆炭疽病菌5種植物病原菌的抑菌效果研究較少，并且對(duì)肉桂丙酮提取物中物質(zhì)成分的分析也不夠深入?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以肉桂丙酮提取物為研究對(duì)象，通過GC-MS技術(shù)對(duì)肉桂丙酮提取物的物質(zhì)組成進(jìn)行分析，并研究其對(duì)5種植物病原菌的作用效果，以期對(duì)肉桂丙酮提取物的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉桂：購(gòu)于貴州省中藥材公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)陳德媛研究員鑒定為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干皮及樹皮；供試菌株： ACCC 38709煙草赤星病菌(Altternariaaltternata)；ACCC 36023茄鏈格孢菌(Alternariasolani)；ACCC 36971多隔鐮刀菌(Fusariumdecemcellulare)；ACCC 30387灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)；ACCC 36201大豆炭疽病菌 (Colletotrichumglycines)。菌株由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院及貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器設(shè)備：HP-6890/HP5973 GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用(美國(guó)惠普公司)，立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌LDZX-40BI(上海申安醫(yī)療器械廠)；DG-411 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(成都電烘箱廠)；萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒托利多儀上海有限公司)；島津LC-10AT型高效液相色譜議(日本島津)；RXZ智能型人工氣候箱(寧波江南儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 肉桂丙酮提取物GC-MS分析 樣品處理：稱取一定量的肉桂粗粉，按1∶10比例采用丙酮室溫密封浸提，每隔1 h進(jìn)行震搖，6 h后放置72 h，濾過，收集濾液，即得。

GC條件：彈性石英毛細(xì)管柱(HP-5MS 5 % Phenyl Methyl Siloxane )(30 m×250 μm×0.25 μm)；采用程序升溫：柱溫50 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min程序升溫至230 ℃，保持20 min；氣化室溫度為250 ℃，載氣為高純度氦氣(99.999 %)，載氣流量2.0 mL/min，柱前壓103.977 kPa ，分流進(jìn)樣為1 μl，分流比為40∶1。

MS條件：采用EI源作離子源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃，電子能量70 eV，發(fā)射電流 34.6 μA，倍增器電壓1936 V，質(zhì)量范圍10～550 amu。

成分分析：通過檢索HP MSD化學(xué)工作站的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)，即Nist98和WILEY275兩個(gè)質(zhì)譜圖庫(kù)，同時(shí)結(jié)合有關(guān)揮發(fā)性物質(zhì)的文獻(xiàn)譜圖解析，從而確認(rèn)所測(cè)樣品揮發(fā)油物質(zhì)的化學(xué)成分。通過HP MSD的化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算，并求出各化學(xué)成分的峰面積的相對(duì)百分含量。

1.2.2 5種植物病原菌半最大效應(yīng)濃度(EC50)測(cè)定 各取1 mL按梯度稀釋好的肉桂丙酮提取物(肉桂丙酮提取物表1)，分別加入預(yù)先滅菌且冷卻至約50 ℃的50 mL PDA培養(yǎng)基中，搖勻。將各組含肉桂丙酮提取物的培養(yǎng)基15 mL倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，即為所需含藥平板。空白對(duì)照組操作同上，僅將肉桂丙酮提取物用等量的丙酮替代。將預(yù)培養(yǎng)的5種植物病原菌用直徑5 mm的打孔器自菌落邊緣切取新鮮菌餅，將菌餅分別接種于各組不同濃度的含藥平板中央，蓋上培養(yǎng)皿蓋，置于培養(yǎng)箱內(nèi)于28 ℃培養(yǎng)，待空白組菌落直徑長(zhǎng)滿2/3平板后，采用十字交叉法量取各組菌落直徑，計(jì)算不同濃度肉桂丙酮提取物對(duì)5種植物病原菌菌絲的抑制百分率。每組設(shè)3個(gè)平行。以各處理組肉桂丙酮提取物對(duì)數(shù)濃度為x軸、菌絲生長(zhǎng)抑制率的生物統(tǒng)計(jì)幾率值為y軸進(jìn)行回歸分析，計(jì)算各供試菌的EC50。

菌落直徑(mm)=測(cè)量值-菌餅直徑

菌絲的抑制百分率(%)=

表1 肉桂丙酮提取物濃度梯度

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂丙酮提取物中的主要化合物

經(jīng)GC-MS分離和鑒定，檢索圖庫(kù)和相關(guān)資料數(shù)據(jù)，肉桂丙酮提取物共檢出10個(gè)峰(圖1)，鑒定出6種化合物(表2)其中，醛類物質(zhì)含量最高，為89.6 %；酮類物質(zhì)其次，為8.33 %；酸類物質(zhì)和稀類物質(zhì)含量占比較小，分別為1.16 %和0.91 %。

2.2 肉桂丙酮提取物對(duì)5種植物病原菌的抑制作用

2.2.1 對(duì)茄鏈格孢菌和煙草赤星病菌的抑制作用 從表3看出，隨著肉桂丙酮提取物濃度的升高，對(duì)茄鏈格孢菌和煙草赤星病菌的抑制作用均呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)。當(dāng)提取物濃度為58.82 mg/L時(shí)，對(duì)鏈格孢菌和煙草赤星病菌的抑制率分別為69.80 %和57.28 %，當(dāng)提取物濃度上升到98.04 mg/L時(shí)，抑制率分別為99.08 %和83.5 %。與茄鏈格孢菌比較，肉桂丙酮提取物對(duì)煙草赤星病菌的作用相對(duì)較弱，提取物濃度為58.82 mg/L時(shí)，對(duì)煙草赤星病菌的抑制率較茄鏈格孢菌的低12.52 百分點(diǎn)；提取物濃度為98.04 mg/L時(shí)，對(duì)煙草赤星病菌的抑菌率較茄鏈格孢菌低15.58百分點(diǎn)，說(shuō)明肉桂丙酮提取物對(duì)茄鏈格孢菌的抑制作用更為敏感。

2.2.2 對(duì)多隔鐮刀菌、灰葡萄孢菌和大豆炭疽病菌的抑制作用 從表4可知，隨著肉桂丙酮提取物濃度的上升，其對(duì)多隔鐮刀菌、灰葡萄孢菌和大豆炭疽病菌的抑制作用均逐漸增強(qiáng)。肉桂丙酮提取物濃度超過120.67 mg/L時(shí)，對(duì)多隔鐮刀菌的抑菌率均大于50 %；當(dāng)提取物濃度為201.12 mg/L時(shí)，抑菌率為88.39 %。肉桂丙酮提取物對(duì)灰葡萄孢菌的抑制作用與多隔鐮刀菌相比，以120.67 mg/L提取物濃度為分界點(diǎn)，當(dāng)提取物濃度>120.67 mg/L時(shí)，對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌率均高于多隔鐮刀菌；而≤120.67 mg/L時(shí)，對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌率均低于多隔鐮刀菌。說(shuō)明，當(dāng)肉桂丙酮提取物濃度較低時(shí)，其對(duì)灰葡萄孢菌的敏感性低于多隔鐮刀菌，而超過一定濃度后，其對(duì)灰葡萄孢菌的抑制作用明顯升高。肉桂丙酮提取物對(duì)大豆炭疽病菌的抑制作用與濃度亦呈現(xiàn)正相關(guān)性。與灰葡萄孢菌的抑菌效果相比，提取物對(duì)大豆炭疽病菌的抑菌效果均低于灰葡萄孢菌。當(dāng)提取物濃度為120.67 mg/L時(shí)，大豆炭疽病菌的抑菌率較灰葡萄孢菌低3.34百分點(diǎn)，當(dāng)提取物濃度為201.12 mg/L時(shí)，其抑菌率較灰葡萄孢菌低4.24百分點(diǎn)；與多隔鐮刀菌相比，提取物濃度為160.89 mg/L時(shí)其抑菌率低0.72百分點(diǎn)，提取物濃度達(dá)到201.12 mg/L時(shí)，抑菌率高出多隔鐮刀菌5.91百分點(diǎn)。說(shuō)明，大豆炭疽病菌比多隔鐮刀菌對(duì)高濃度肉桂丙酮提取物更加敏感。

圖1 肉桂丙酮提取物揮發(fā)性成分總離子流圖譜Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of acetone extract fromC.cassia

表2 肉桂丙酮提取物的主要揮發(fā)性成分及相對(duì)含量

表3 肉桂丙酮提取物對(duì)茄鏈格孢菌和煙草赤星病菌的抑制效果

表4 肉桂丙酮提取物對(duì)多隔鐮刀菌、灰葡萄孢菌和大豆炭疽病菌的抑制效果

表5 肉桂丙酮提取物對(duì)5種植物病原菌的毒力回歸方程及EC50值

2.2.3 毒力回歸方程及EC50從表5看出，肉桂丙酮提取物對(duì)5種植物病原菌的抑制作用均與提取物濃度呈正相關(guān)，肉桂丙酮提取物對(duì)茄鏈格孢菌的毒力最大，EC50為45.68 mg/L，對(duì)大豆炭疽病菌的毒力最小，EC50為105.09 mg/L。根據(jù)毒力回歸方程，提取物對(duì)茄鏈格孢菌最敏感，其后依次為灰葡萄孢菌、大豆炭疽病菌以及多隔鐮刀菌，對(duì)煙草赤星病菌的敏感程度最差。

3 討 論

目前，關(guān)于植物精油對(duì)病原真菌的作用機(jī)制，主要是通過破壞病菌細(xì)胞或菌絲體結(jié)構(gòu)[5]，或破壞細(xì)胞代謝系統(tǒng)[6]，抑制菌體及孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)[7]，從而阻斷病原菌后代產(chǎn)生而達(dá)到抑菌效果。有研究表明，植物精油的抗菌活性與其化學(xué)成分關(guān)系密切，其抑菌效果受主成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)影響很大。通過GC-MS對(duì)肉桂丙酮提取物成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)提取物中肉桂醛含量最高。肉桂醛屬醛類有機(jī)化合物，其廣譜抗菌作用已被大量學(xué)者佐證，并且有研究表明，醛類中電子容納能力的強(qiáng)弱以及飽和程度與其抗菌效果的影響有相關(guān)性，具有與病原菌生物膜脂成分中分子結(jié)構(gòu)相似成分的植物精油，其抑菌作用較強(qiáng)[8]。

研究結(jié)果表明，肉桂丙酮提取物對(duì)茄鏈格孢菌、煙草赤星病菌等5種植物病原菌均有較好的抑制效果。但因各類真菌所屬不同類別，因此提取物對(duì)其抗菌效果存在一定差異。其中，對(duì)茄鏈格孢菌抑菌效果最好，敏感性最強(qiáng)，其可能是因?yàn)槿夤鸨崛∥镏腥夤鹑┑姆肿咏Y(jié)構(gòu)具有與茄鏈格孢菌生物膜相似的分子結(jié)構(gòu)，使得肉桂醛透過細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)膜，從而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部[9]，破壞膜的滲透性[10]，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄而使細(xì)胞死亡[11]。

我國(guó)物產(chǎn)豐饒，植物資源豐富，具有開發(fā)天然防腐保鮮劑的潛在優(yōu)勢(shì)。研究結(jié)果還表明，肉桂提取物不僅對(duì)植物生長(zhǎng)期間可能感染的病原菌有抑制作用，對(duì)貯藏期可能感染的病原菌同樣具有抑制作用。肉桂提取物從農(nóng)產(chǎn)品的種植到貯藏階段均能表現(xiàn)出較好的抑菌防腐效果，因此，可為研究學(xué)者提供一定參考依據(jù)，為拓寬肉桂應(yīng)用范圍提供借鑒，具有良好的開發(fā)前景。

4 結(jié) 論

在肉桂丙酮提取物中共分離鑒定出4-甲基-4-羥基-2-戊酮、肉桂醛、α-衣蘭油烯、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛和棕櫚酸6種化合物。肉桂丙酮提取物對(duì)茄鏈格孢菌、煙草赤星病菌、多隔鐮刀菌、灰葡萄孢菌以及大豆炭疽病菌5種植物病原菌均有較好的抑制效果。