黃利君 常凡 莫展

[摘要] 目的 驗證時間分辨熒光分析法檢測乙肝表面抗原（HBsAg）的檢出限（LOD），評價參考區(qū)間的合適性。 方法 自2017年10月～2018年1月對HBsAg二級標準物倍比稀釋后采用時間分辨熒光分析法及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進行配對檢測，標準物濃度除以稀釋后檢測結(jié)果出現(xiàn)陰性的上一稀釋度為LOD，驗證廠商的聲明，比較兩種方法檢測同一稀釋度樣品結(jié)果，評估廠商聲明的參考區(qū)間的合適性;根據(jù)美國臨床實驗室標準委員會（CLSI）EP17-A2規(guī)定的方法建立空白限（LOB）及LOD，評價已建立的LOD作為參考區(qū)間上限的合適性。 結(jié)果 時間分辨熒光法的LOD驗證結(jié)果為0.1 U/mL，與廠商聲明相符。如使用時間分辨熒光檢測系統(tǒng)廠商聲明的參考區(qū)間，標準物稀釋3倍后結(jié)果判為假陰性，與ELISA檢測結(jié)果不符。重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院（以下簡稱“我院”）檢驗科建立的HBsAg的LOB及LOD分別為0.048 ng/mL及0.137 ng/mL，如以我院檢驗科建立的LOD制訂參考區(qū)間，稀釋3倍后兩種方法結(jié)果一致，均為陽性。 結(jié)論 時間分辨免疫熒光分析系統(tǒng)聲明的LOD可以接受，但廠商聲明的參考區(qū)間不適宜，易導致假陰性。檢驗科應(yīng)建立自己的LOD來制訂參考區(qū)間。建議在對病毒標志物定量檢測項目進行性能驗證時增加參考區(qū)間的驗證。

[關(guān)鍵詞] 乙肝表面抗原;EasyCuta全自動時間分辨免疫熒光分析;LOD;參考區(qū)間

[中圖分類號] R446.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（a）-0149-04

[Abstract] Objectives To verify the detection limit （LOD） of hepatitis B surface antigen （HBsAg） by time-resolved fluorimmunoassay， and to evaluate the suitability of the reference interval. Methods From October 2017 to January 2018， the HBsAg secondary standard substance was diluted and then paired with time-resolved fluorescence method and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for detection， the detection limit was the last dilution degree with negative test results after standard substance concentration divided by dilution， to verify the manufacturer′s statement， the results of samples with the same dilution degree detected by the two methods was compared， and the suitability of the reference interval declared by the manufacturer was evaluated. According to the American clinical laboratory standards board （CLSI） EP17-A2 method， create blank limits （LOB） and LOD， and the suitability of the established LOD as the upper limit of the reference interval was evaluated. Results The detection limit of time-resolved fluorimmunoassay method was 0.1 U/mL， which was consistent with the manufacturer′s statement. If the reference interval declared by the manufacturer of the time-resolved fluorimmunoassay detection system was used， the standard substance was diluted 3 times and the result was found to be false negative， which was inconsistent with the ELISA test result， the LOB and LOD of HBsAg established in Department Clinical Laboratory， Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University （hereinafter heferred to as "our hospital"）， were 0.048 ng/mL and 0.137 ng/mL， respectively. If the reference interval was established with the LOD established chinical laboratory of our hospieal， the results of the two methods were consistent after 3 times of dilution， and both were positive. Conclusion The detection limit declared by the time-resolved fluorimmunoassay analysis system is acceptable， but the reference interval declared by the manufacturer is not appropriate， which is likely to lead to false negative. The clinical laboratory should establish its own LOD to establish the reference interval. It is suggested to increase the validation of the reference interval in the performance verification of the quantitative detection items of virus markers.

[Key words] Hepatitis B surface antigen; EasyCuta automatic time-resolved fluorescence immunoassay; Limit of detection; Reference interval

目前定量檢測病毒標志物的方法（如時間分辨熒光分析法及化學發(fā)光方法）雖聲稱是一個定量實驗，但其本質(zhì)就是一個通過參考區(qū)間對定量結(jié)果進行陰陽性判斷的定性實驗，其聲明的參考區(qū)間的上限其實就是檢出限（LOD）。以前關(guān)于LOD概念的理解不一，導致各實驗室對LOD的建立及驗證方法不統(tǒng)一[1-3]。LOD是指樣本中可被檢測到的最低分析物濃度，可以在規(guī)定的可能性條件下予以檢出[4-5]，亦即是C95濃度（進行100次檢測有95次檢測結(jié)果為陽性的濃度）[6-7]。LOD代表定性實驗的診斷靈敏度，它不同于空白限（LOB）即C50濃度（進行100次檢測有50%的結(jié)果為陽性，50%的結(jié)果為陰性），許多實驗室卻誤把LOB作為LOD。目前雖有關(guān)于時間分辨熒光分析法LOD驗證的文獻報道[8]，但報道誤把LOB作為LOD及參考區(qū)間下限進行了評估、驗證，且我們工作中發(fā)現(xiàn)如參照廠商聲明的參考區(qū)間，一些弱陽性標本在時間分辨檢測系統(tǒng)上檢測結(jié)果為假陰性。乙肝表面抗原（HbsAg）是一個診斷乙肝的重要指標，如因HBsAg參考區(qū)間不適而導致乙肝漏檢，會給臨床診斷、獻血人員及器官移植等導致嚴重后果，因此，有必要對時間分辨檢測系統(tǒng)檢測HBsAg的LOD及參考區(qū)間均進行驗證、評價，適當時重新建立LOD和/或參考區(qū)間。

1 材料與方法

1.1 一般材料

自2017年10月～2018年1月采用HBsAg二級標準物（購自于國家標準物質(zhì)網(wǎng)，濃度：0.2 U/mL）作為LOD及參考區(qū)間的驗證樣本，使用樣品稀釋液制備5個空白樣本，并通過空白樣本測量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析得到的LOB;用HBsAg定量校準品（購自新波生物，濃度：0.21 ng/mL）制備HBsAg濃度值介于LOB（1～4）倍的4個低濃度樣本（濃度分別為0.050、0.100、0.015、0.210 ng/mL）作為LOD建立的樣本[5，9]。

1.2 儀器與試劑

EasyCuta全自動時間分辨免疫熒光分析儀：（生產(chǎn)廠家：新波生物技術(shù)有限公司）;MB-580型酶標儀：（生產(chǎn)廠家：深圳匯松科技發(fā)展有限公司）;HBsAg定量檢測試劑盒：（生產(chǎn)廠家：新波生物技術(shù)有限公司;批號1：8600073730，批號2：86000752000）;乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原診斷試劑盒：（生產(chǎn)廠家：珠海麗珠，批號：B20170820）。

1.3 方法

1.3.1 LOD驗證? 對HBsAg標準品進行1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的倍比稀釋，每個稀釋度同時使用時間分辨熒光分析法及酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）進行檢測，對二者結(jié)果進行比較評價，標準物濃度除以稀釋后檢測結(jié)果剛好出現(xiàn)陰性的上一稀釋度為LOD。如驗證所得的LOD≤廠商聲明的LOD，則廠商聲明的LOD可以接受，否則不能接受，需重新建立LOD。

1.3.2 參考區(qū)間驗證? 將兩種方法檢測HBsAg標準品系列倍比稀釋后樣品的定性結(jié)果（即陰陽性結(jié)果）進行比較，以ELISA結(jié)果作為參考結(jié)果，評價廠商提供的參考區(qū)間的合適性（時間分辨免疫熒光分析檢測系統(tǒng)檢測HBsAg是根據(jù)廠商提供的參考區(qū)間作為陰陽性判斷標準，大于參考區(qū)間上限即為陽性，參考區(qū)間內(nèi)為陰性），適時建立LOD。

1.3.3 時間分辨檢測系統(tǒng)LOD的建立? 采用EP17-A2推薦方法[5，9]，對EasyCuta全自動時間免疫熒光分析儀進行校準，嚴格按照標準作業(yè)程序（SOP）文件進行操作，每個空白樣本每天測量4次，連續(xù)測定3 d，獲得60個數(shù)據(jù);每個低濃度樣本每天測5次，連續(xù)測量3 d，獲得60個數(shù)據(jù)。每批測量均做室內(nèi)質(zhì)控，剔除失控批次的測量值，糾正失控后重做，按照“1/3”原則剔除離群值，剔除的離群值需重新測量進行補充。設(shè)定Ⅰ類錯誤（α）和Ⅱ類錯誤（β）均為5%，即α = β = 5%，并根據(jù)檢測結(jié)果的正態(tài)分布情況選擇使用參數(shù)方法或非參數(shù)方法建立LOB及LOD。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 17.0對檢測結(jié)果進行正態(tài)分布性檢驗，根據(jù)結(jié)果選擇參數(shù)或非參數(shù)方法建立LOB或LOD。

2 結(jié)果

2.1 廠商聲明LOD的驗證

根據(jù)廠商提供的參考區(qū)間，標準物稀釋2倍時，時間分辨熒光分析法檢測結(jié)果為陽性，稀釋3倍時檢測結(jié)果為陰性，因此其LOD為0.1 U/mL（0.2/2），與廠商聲明的LOD一致，可以接受。此外，根據(jù)時間分辨系統(tǒng)廠商提供的參考區(qū)間，當室內(nèi)質(zhì)控品稀釋2倍時，兩種方法定性檢測結(jié)果一致（均為陽性），稀釋3倍時，時間分辨熒光分析法定性檢測結(jié)果為陰性，而ELISA定性檢測結(jié)果仍為陽性。見表1。

2.2 LOB及LOD的建立

2.2.1 LOB的建立? LOB空白樣本測定結(jié)果，見表2，經(jīng)正態(tài)性檢驗呈非正態(tài)分布，依據(jù)EP17-A2，使用非參數(shù)程序估計LOB，LOB = PctB100-α，即第95百分位數(shù)值為LOB，得到第95百分位數(shù)值為第57和第58個測量結(jié)果的均值。將空白樣本的60個檢測數(shù)據(jù)按從小到大的順序排列，第57、58個位置上的檢測值均為0.048 ng/mL，故LOB = X57+0.5（X58-X57）=0.048 ng/mL。

2.2.2 LOD的建立? LOD4個低濃度樣本測定結(jié)果，見表3，經(jīng)正態(tài)性檢驗呈非正態(tài)分布，依據(jù)EP17-A2，使用非參數(shù)程序估計LOD，即LOD = LOB+DS.β，DS.β是系列低濃度樣本測定結(jié)果中位數(shù)的值與系列低濃度樣本測量結(jié)果第5百分位數(shù)值之差，可得出DS.β = 0.089 ng/mL，則LOD = 0.137 ng/mL。

3 討論

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共衛(wèi)生問題。中國每年約有30萬人死于HBV相關(guān)肝癌或肝硬化，占全球HBV相關(guān)死亡人數(shù)的37%～50%[10-12]，除損傷肝臟外，還可引起腎病、心肌損害和膽管炎等[13-14]。HBV主要傳播途徑為血液傳播（如輸血過程中感染）、醫(yī)源性感染、母嬰傳播和性傳播，最新報道[15-16]表明其在醫(yī)院醫(yī)師職業(yè)暴露中占首位。HBsAg作為HBV感染的標志物，在0.1 μg/L水平即具有傳染性，因此在乙型肝炎的診斷、術(shù)前檢查、輸血前檢查和獻血人員的篩選方面都有重要的臨床意義[17-18]。有報道[19]表明，時間分辨熒光分析法檢測HBsAg雖具有較高的靈敏度（96.97%），但在臨界濃度附近仍存在陰陽性不一致的情況，據(jù)統(tǒng)計學分析，臨界濃度各有50%的假陽性和假陰性，因而，驗證及建立檢測限對于臨床實驗室能最大限度地檢出可疑標本，避免漏檢顯得十分重要[20]。

因陽性室內(nèi)質(zhì)控物或標準物質(zhì)的濃度單位均為U/mL，臨床診斷明確的患者樣本，又無法對其HBsAg準確賦值，因此時間分辨熒光檢測系統(tǒng)廠商聲明的HBsAgLOD（0.1 U/mL）也是使用的U/mL單位，據(jù)此，本研究亦采用稀釋標準物進行檢測的方法進行驗證，驗證結(jié)果與廠商聲明的一致。

從本研究ELISA法及時間分辨熒光分析法配對實驗結(jié)果可以看出：稀釋2倍時，二者的定性結(jié)果一致。當樣本稀釋3倍時，二者結(jié)果不一致：ELISA測量的S/CO為0.1443，高于Cutoff值（0.105），也超過Cutoff值的灰區(qū)范圍（0.105±20%），可以非常確切地判斷為陽性，而時間分辨測量結(jié)果為0.156 ng/mL，如果按照廠商聲明的參考區(qū)間（<0.2 ng/mL），應(yīng)該判為陰性。因此，對于濃度在0.137～0.200 ng/mL范圍區(qū)間的樣本使用廠商聲明的參考區(qū)間易導致假陰性，廠商聲明的參考區(qū)間不合適，易導致臨床漏診，檢驗科應(yīng)該根據(jù)自行建立的LOD建立參考區(qū)間。

LOD應(yīng)作為參考區(qū)間上限，亦既是C95濃度。我院檢驗科室自行建立的LOB及LOD分別為0.048 ng/mL及0.137 ng/mL（LOD低于廠家聲明的0.200 ng/mL參考區(qū)間上限），據(jù)此我們建立的參考區(qū)間為<0～0.137 ng/mL。在兩種方法配對實驗中，使用我們建立的參考區(qū)間，標準物稀釋3倍時，時間分辨檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果（0.156 ng/mL）應(yīng)判為陽性，就與ELISA一致了。當樣本稀釋4倍時，雖然兩種方法檢測結(jié)果不一致：時間分辨檢測結(jié)果為陰性（使用本研究LOD即0.137 ng/mL作為參考值），ELISA檢測結(jié)果為陽性，但結(jié)果均處于灰區(qū)，處于灰區(qū)的結(jié)果具有不確定性[21-23]，需進一步確認，因此僅憑這一次實驗結(jié)果尚不能確定二者測量結(jié)果的不一致。

如果采用我院檢驗科建立的LOD作為判斷陰陽性的閾值，從時間分辨熒光法及ELISA配對實驗結(jié)果可以看出，標準物質(zhì)（濃度為0.2 U/mL）稀釋3倍后兩種方法的測量結(jié)果一致，仍為陽性，那么時間分辨檢測系統(tǒng)的LOD（以國際單位作為濃度單位）應(yīng)為0.07 U/mL（0.2/3），小于廠商聲明的0.1 U/mL，廠商聲明亦可以接受。

綜上所述，時間分辨免疫熒光法廠商聲明的LOD在實驗室得到驗證，廠商聲明的參考區(qū)間不合適，易導致誤診，實驗室應(yīng)建立自己的LOB及LOD，應(yīng)以LOD作為分析閾值，建立參考區(qū)間。因此在病毒標志物定量檢測項目的性能驗證中除驗證CL39明確要求的符合率、LOD外，建議實驗室增加驗證廠商聲明的參考區(qū)間。

[參考文獻]

[1]? 唐恩躍，何增品，崔曉花，等.基于CLSI EP12-A2文件要求的乙型肝炎五項定性檢測性能驗證[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2016，37（24）：3443-3444.

[2]? 方婉仙，李志雄，董志寧，等.總前列腺特異性抗原定量測定試劑盒（化學發(fā)光免疫分析法）的性能驗證[J].分子診斷與治療雜志，2015，7（5）：323-327.

[3]? 沙廣群，王啟龍，劉萍，等.游離前列腺特異性抗原性能指標的建立[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2017，14（14）：2097-2099.

[4]? 張秀明，馮仁豐.正確理解和使用分析靈敏度及LOD[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2014，37（9）：669-672.

[5]? CLSI. Evaluation of detection capability for clinical laboratory measurement procedures [M]. PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2012.

[6]? 楊有業(yè)，張秀明.臨床檢驗方法學評價[M].北京：北京人民衛(wèi)生出版社，2008：142-167.

[7]? CLSI. EP12-A2 User protocol for evaluation of qualitative test performance;approved guideline [S]. PA，USA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2009.

[8]? 黃永富，黃介飛，叢輝，等.時間分辨熒光免疫分析法檢測乙型肝炎血清標志物的分析方法性能驗證[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2011，32（5）：543-547.

[9]? 康鳳鳳，王薇，王治國.臨床實驗室檢測方法空白限、LOD和定量限評價新方法[J].中國衛(wèi)生統(tǒng)計，2014，31（5）：901-904.

[10]? Ji Z，Wang T，Shao Z，et al. A population-based study examining hepatitis B virus infection and immunization rates in Northwest China [J]. PLoS One，2014，9（5）：e97 474.

[11]? 何龍芳.抗病毒治療停藥后乙型肝炎復(fù)發(fā)與血清HBV DNA水平的相關(guān)性分析[J].中國醫(yī)藥科學，2017，7（21）：251-254.

[12]? 趙薇.血清中乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄的檢測在母嬰垂直傳播中的臨床意義[J].中國醫(yī)藥導報，2017，14（15）：117-120.

[13]? Trépo C，Chan HL，Lok A. Hepatitis B virus infection [J]. The Lancet，2014，384（9959）：2053-2063.

[14]? Cai QC，Zhao SQ，Shi TD，et al. Relationship between hepatitis B virus infection and chronic kidney disease in Asian populations：a meta-analysis [J]. Ren Fail，2016， 38（10）：1581-1588.

[15]? 張紅巖，仲曙光.醫(yī)院醫(yī)師職業(yè)暴露危險因素監(jiān)控與防護對策分析[J].中國病原生物學雜志，2017（9）：851-854.

[16]? 姜新華，高國生，胡愛榮.國產(chǎn)PCR試劑和COBAS系統(tǒng)血清HBV-DNA檢測結(jié)果不一致的原因分析[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2017，55（2）：108-101.

[17]? 陳德娟.輸血和手術(shù)前患者血清5項感染性指標調(diào)查結(jié)果分析[J].中國病原生物學雜志，2013（4）：355-357.

[18]? 曾健強，聶冬梅，馬蘭，等.深圳無償獻血乙肝篩查陽性結(jié)果確證分析[J].實用預(yù)防醫(yī)學，2006，13（2）：258-259.

[19]? 莫展，曾強，冉季于，等.時間分辨熒光免疫技術(shù)測量乙肝標志物可疑結(jié)果分析與處理[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2014（15）：2188-2190.

[20]? 李金明.定性測定的性能驗證[C]//中華醫(yī)學第九次全國檢驗醫(yī)學學術(shù)會議暨中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗管理專業(yè)委員會第六屆全國臨床檢驗實驗室管理學術(shù)會議，北京，2011：45-46.

[21]? 陳洪生，陳佳微，張三明，等.ELISA“灰區(qū)”范圍的設(shè)定對獻血者血液檢測安全和血源保護的意義[J].中國輸血雜志，2015，28（9）：1140-1141.

[22]? 張艷麗.HBsAg ELISA灰區(qū)、弱反應(yīng)標本與FQ-PCR檢測結(jié)果對比分析[J].臨床血液學雜志（輸血與檢驗），2016（5）：794-796.

[23]? 陳靜，李幫芬，先秀，等.酶聯(lián)免疫四項檢測結(jié)果灰區(qū)與窗口期感染的關(guān)系[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2017，14（17）：2554-2556.

（收稿日期：2018-07-30? 本文編輯：封? ?華）