梁志剛 孫旭文 劉竹麗

[摘要] 目的 探討褐藻多糖硫酸酯（FUC）對帕金森?。≒D）細胞模型的保護作用及機制。 方法 采用100 μmol/L MPP+損傷的MN9D細胞制作PD模型，用MTS檢測FUC預處理后PD細胞模型的細胞存活率。熒光檢測法測定細胞內活性氧（ROS），熒光素酶法檢測細胞內Caspase-3的活性變化，Western blot檢測凋亡相關蛋白Bax及Bcl-2的變化。 結果 FUC 100 μmol/L作用24 h明顯增加了MPP+損傷的MN9D細胞存活率，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）;FUC預保護明顯降低了MPP+損傷3 h的MN9D細胞內ROS活性及6 h時Caspase-3的表達，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）;FUC、司來吉蘭預保護后MN9D細胞凋亡相關蛋白Bax表達明顯下降，而Bcl-2表達明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。 結論 褐藻多糖硫酸酯可能通過抗氧化、降低Caspase-3表達、抑制細胞凋亡來保護PD細胞模型。

[關鍵詞] 褐藻多糖硫酸酯;帕金森病;MN9D細胞;氧化應激;細胞凋亡

[中圖分類號] R742.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（a）-0020-05

[Abstract] Objective To explore the protective effect of fucoidan （FUC） on the cell model of Parkinson′s disease （PD） and its mechanism. Methods PD model was established by MN9D cells which were damaged by 100 μmol/L MPP+. The cell viability of PD cell model was detected by MTS after FUC pretreatment. The reactive oxygen species （ROS） was measured by fluorescence detection， the activity of Caspase-3 in cells was measured by luciferase， the expression changes of apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2 were measured by Western blot. Results After application of 12 h， FUC 100 μmol/L significantly increased the cell viability of MN9D cells damaged by MPP+， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The FUC pretreatment reduced the activity of intracellular ROS of MN9D cell damaged by MPP+ in 3 h and the expression of Caspase-3 in 6 h， there were highly statistically significant differences （P < 0.01）. After FUC and Selegiline pretreatment， the expression of MN9D cell apoptosis-related protein Bax was decreased， and the expression of Bcl-2 was increased， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Fucoidan may protect the PD cell models through anti-oxidation， reducing the expression of Caspase-3 and inhibiting cell apoptosis.

[Key words] Fucoidan; Parkinson′s disease; MN9D cell; Oxidation stress; Cell apoptosis

帕金森病（PD）是一種常見于中老年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，目前其確切發(fā)病機制尚不清楚。研究認為氧化應激與細胞凋亡在PD的發(fā)病中起重要作用[1]。褐藻多糖硫酸酯（FUC）是從褐藻中提取的具有抗氧化、抗凝及抗老化作用的多糖。研究表明，F(xiàn)UC具有對阿爾茨海默?。ˋD）模型的神經(jīng)保護作用[3]，我們推測FUC對于PD亦可能具有一定作用。本研究通過MPP+損傷小鼠中腦多巴胺能細胞系（MN9D）細胞制作PD細胞模型，觀察FUC對細胞模型氧化應激及凋亡的影響，以探討其對PD模型的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

MN9D細胞（購自中國醫(yī)學科學院，本院中心實驗室保存）;DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Gibco BRL公司產品，11320-033）;新生牛血清（NCS，奧地利PAA公司）;胎牛血清（Gibco公司）;MPP+ idione（美國Sigma公司）;FUC（中國生物檢驗中心，純度99.8%，Z20030 053）。陽性對照藥物司來吉蘭（SEL，芬蘭奧立安公司，H20040400）[4]。MTS細胞活力測定試劑盒（G1112）、Caspase-3活性熒光素酶檢測試劑盒（PROMAGE公司，G8090）;細胞內活性氧（ROS）熒光檢測試劑盒（Cell Biolabs公司，K936）;小鼠單克隆Bax（B8249）和Bcl-2（SAB4500003）抗體、GAPDH（G9545）購自Sigma公司。其他試劑均為分析純（購自Sigma公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)、PD細胞模型建立及實驗分組

從液氮罐中取出凍存MN9D細胞管，迅速放入37°C水浴后，離心半徑13 cm，1000 r/min離心5 min后棄上清，沉淀物用DMEM/F12+10% NCS培養(yǎng)液混懸，吸出細胞懸液，用適量培養(yǎng)液稀釋后，轉入無菌培養(yǎng)瓶37°C、5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，細胞培養(yǎng)48 h進入指數(shù)生長期后進行傳代培養(yǎng)并進行試驗。將MN9D細胞接種于Poly-L-lysine包被的96孔板，接種密度為1×105/mL，每孔接種體積為100 μL。細胞穩(wěn)定培養(yǎng)24 h后更換含5% NCS的DMEM/F12培養(yǎng)基。不同濃度（0、50、100、200、300、400 μmol/L）的MPP+損傷MN9D細胞12～48 h后觀察細胞存活率，篩選出最適濃度（100 μmol/L）MPP+，制備PD細胞模型;細胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度（1、10、100 μmol/L）的FUC預保護1 h后，加入100 μmol/L的MPP+作用24 h，對照組加入相同體積的生理鹽水，MTS法檢測細胞存活率，篩選出FUC最有效的神經(jīng)保護濃度。然后將細胞用簡單隨機分組法分為對照組、模型組（MPP+ 100 μmol/L）、FUC組（FUC 100 μmol/L+MPP+）、SEL組（SEL 10 μmol/L+MPP+）。各組分別在MPP+作用3 h時觀察ROS的活性，并在6 h時進行Caspase-3活性及細胞內凋亡相關蛋白表達的測定，24 h分別進行細胞活力和形態(tài)學檢測。

1.3 細胞存活率及細胞內ROS、Caspase-3的檢測

細胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，分別加入FUC預保護1 h后，加入100 μmol/L的MPP+共孵育24 h，對照組僅加入相同體積的生理鹽水，吸取培養(yǎng)液，更換含5% NCS的DMEM/F12培養(yǎng)基，96孔板內每孔加入10 μL MTS試劑細胞培養(yǎng)箱孵育1 h后，加入MTS溶液10 μL/孔，放入CO2孵箱，5%CO2，37℃孵育1～2 h。用酶標儀（490 nm波長）測OD值，分別把模型組及不同濃度FUC組OD值/對照組OD值，比值計數(shù)后各組比較。結果重復3遍。100 μmol/L FUC預處理MN9D細胞1 h，然后加入100 μmol/L MPP+共孵育3 h，1 μg/mL的DCF-DA孵育15 min，倒置熒光顯微鏡觀察細胞內ROS情況，并應用熒光檢測儀（480 nm波長）檢測ROS的活性，熒光值采用RFU值表達;用100 μmol/L的FUC預處理MN9D細胞1 h，然后加入100 μmol/L MPP+共孵育6 h，然后移液器洗去培養(yǎng)液，采用Caspase-Glo Assays（a，b）（Caspase-Glo檢測試劑盒）。加入Caspase-Glo試劑50 μL，隨后加入重組螢光素酶50 μL，然后用Caspase熒光素酶儀器檢測細胞內Caspase-3的活性，熒光素酶活性單位用RLU值表達。

1.4 細胞形態(tài)學觀察

FUC組的FUC預保護孵育1 h后，SEL組在10 μmol/L的SEL預保護1 h，與模型組同時加入100 μmol/L的MPP+共孵育24 h，對照組加入相同體積的生理鹽水，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，隨機取4個視野，100×，觀察各組細胞大少形態(tài)及視野里細胞數(shù)目。

1.5 細胞內相關蛋白表達

用100 μmol/L FUC預處理MN9D細胞1 h，SEL組在10 μmol/L的SEL預保護1 h，與模型組同時加入100 μmol/L MPP+共孵育6 h，后提取各組細胞蛋白，行Western blot檢測Bax及Bcl-2蛋白表達，操作方法：向細胞培養(yǎng)板6孔板中加入蛋白裂解液99 μL、cocktail蛋白酶抑制劑1 μL，冰上裂解5 min，用細胞刮收集細胞，移液器把裂解物移到Eppendorf管中，裂解產物超聲處理3次。冰浴中靜置30 min，12 000 r/min，離心半徑6 cm，4℃，離心5 min。將上清移入另一Eppendorf管中，棄去沉，95℃變性5 min，存于-20℃冰箱中待用。灌制10%～12%分離膠和5%積層膠，樣品置于凝膠加樣緩沖液中，電泳槽中充滿電泳緩沖液，加入60 μg樣品后連接電源，80 V，20 min，再換成120 V，80～100 min，電泳后取出凝膠進行轉膜，將凝膠和硝酸纖維素膜裝入標有正、負極的轉膜夾板中，置于含有電泳轉移緩沖液的轉移電泳槽中，100 V，60 min。取出硝酸纖維素濾膜，PBS洗膜10 min，置于含5%脫脂奶粉PBS溶液中封閉，室溫輕搖1～2 h。分別加入含5%脫脂奶粉PBST稀釋的小鼠抗Bax（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000），并加入用于作為內參的小鼠抗GAPDH抗體（1∶10 000），4℃孵育過夜。次日取出后室溫放置30 min，PBST洗膜3次，每次10 min，加入IRDye800（1∶10 000）標記羊抗小鼠二抗，室溫輕搖1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，用PBS洗去膜上殘留的Tween-20，隨后用Odyssey紅外成像系統(tǒng)對膜進行掃描，并計算各蛋白條帶OD值，實驗重復4次，取4次均值，各實驗組OD值/對照組OD值進行各組之間的比較。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用Prism 5.0軟件。計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，并繼之以Tukey post-hoc檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MPP+損傷MN9D細胞存活率的變化及FUC的有效濃度

與對照組（0 μmol/L）比較，50～400 μmol/L MPP+作用12 h以上，MN9D細胞存活率明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。其中100 μmol/L MPP+作用MN9D細胞24 h，MN9D細胞存活率下降50%左右。與模型組比較，F(xiàn)UC 10、100 μmol/L作用24 h明顯增加了MPP+損傷的MN9D細胞存活率，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見圖1。

2.2 實驗各組MN9D細胞形態(tài)的變化

與對照組（圖2A）比較，模型組細胞形態(tài)變圓，胞體變小，突起變短或消失（圖2B）;與模型組比較，F(xiàn)UC組細胞數(shù)目增多，細胞形態(tài)基本正常，突起基本正常（圖2C），SEL組細胞形態(tài)明顯好轉，細胞數(shù)目增加（圖2D）。

A：對照組;B：模型組;C：FUC組;D：SEL組。FUC：褐藻多糖硫酸酯;SEL：司來吉蘭

圖2? ?光學顯微鏡下各組MN9D細胞形態(tài)（100×）

2.3 各組ROS、Caspase-3、Bax/Bcl-2表達

2.3.1 各組細胞內ROS、Caspase-3活性的測定? 與對照組比較，模型組ROS熒光明顯增加（P < 0.01）;與模型組比較，F(xiàn)UC組、SEL組ROS熒光強度減少（P < 0.01）。與對照組比較，模型組Caspase-3活力明顯增加（P < 0.01），F(xiàn)UC組、SEL組細胞內Caspase-3活力較模型組明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見圖3。

2.3.2 各組細胞內凋亡相關蛋白的Western blot蛋白表達條帶及OD值比較? 與對照組比較，模型組Bax表達明顯增加，Bcl-2表達明顯下降（P < 0.01），而FUC組、SEL組Bax蛋白表達較模型組明顯下降，Bcl-2蛋白表達較模型組明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見圖4。

3 討論

PD是第二大神經(jīng)系統(tǒng)變性病[1]，病程進展較慢，是遺傳易感性、年齡老化、環(huán)境因素共同作用的結果[5]，主要病理改變?yōu)槎喟桶纺苌窠?jīng)元壞死，紋狀體內多巴胺含量減少，從而出現(xiàn)錐體外系癥狀。目前認為氧化應激及細胞凋亡在PD 發(fā)病機制中具有重要作用[6-7]，因此尋求具有神經(jīng)保護作用的治療藥物是當前PD防治的研究熱點[8]。

多糖是生物體內重要的生物大分子，是動植物中的支持組織和重要的能量來源[9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）具有在細胞內溶酶體和線粒體水平上對氧化應激誘導細胞凋亡發(fā)生早期負調控的作用。FUC與GAG結構成分非常類似，為了驗證FUC對PD神經(jīng)保護機制，本研究觀察了FUC對MPP+誘導的MN9D細胞模型保護作用。結果發(fā)現(xiàn)FUC可有效對抗MPP+造成的MN9D細胞死亡，并呈明顯的劑量-效應關系。既往研究表明，F(xiàn)UC在體外具有良好的自由基清除能力[11]，本研究結果支持FUC的神經(jīng)保護作用機制與抗氧化應激有關。MPP+毒性作用均和氧化應激密切相關[12]，MPP+必須經(jīng)神經(jīng)元細胞膜上的DAT特異性攝取進入細胞后，通過抑制線粒體復合物Ⅰ和氧化應激發(fā)揮毒性作用，并能導致多巴胺能細胞凋亡[13]，根據(jù)我們的前期實驗[14]，選用100 μmol/L MPP+損傷MN9D細胞作為PD細胞模型。本研究發(fā)現(xiàn)100 μmol/L FUC可以拮抗MPP+的神經(jīng)毒性，使MN9D細胞的活力提高近30%，保護了MPP+損傷的MN9D細胞形態(tài)，并能減少MPP+損傷3 h的MN9D細胞內ROS的產生，同時降低了MPP+損傷6 h后細胞內Caspase-3的活性，進而降低了MPP+誘導6 h的MN9D細胞凋亡蛋白Bax的表達，升高了Bcl-2的表達，改善了凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2的表達失衡。提示FUC可能通過降低PD細胞模型細胞內ROS的生成，進一步減少ROS導致的Caspase級聯(lián)反應，進而抑制細胞凋亡，保護MN9D細胞。

研究表明[15-16]，ROS的產生在PD的發(fā)生中有重要的作用，并是MPP+損傷級聯(lián)效應的上游事件。ROS通過促使線粒體釋放細胞色素C，進而激活凋亡通路的信號分子Caspase-9和Caspase-3[17]，誘導細胞凋亡[18]，最終導致神經(jīng)元的死亡。本研究結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UC可以通過抑制ROS的產生進而抑制Caspase-3的激活。促凋亡蛋白Bax與凋亡抑制蛋白Bcl-2在細胞凋亡中起重要作用[19]，二者的失衡會導致細胞凋亡，而細胞凋亡參與了PD的發(fā)生[20]。本研究觀察了FUC對MN9D細胞模型Bax及Bcl-2表達的作用，結果發(fā)現(xiàn)FUC組及SEL組凋亡相關蛋白Bax表達明顯下降，而Bcl-2表達明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。線粒體膜電位是線粒體損傷的早期標記，線粒體損傷是導致細胞內ROS升高的主要原因，并互為因果[21]。本研究中發(fā)現(xiàn)FUC減少了Caspase級聯(lián)反應，減少了細胞凋亡相關蛋白Bax表達，增加了Bcl-2的表達，F(xiàn)UC對細胞線粒體的保護作用及可能機制需要進一步深入研究。

本研究在PD細胞模型上提示FUC能通過降低細胞內ROS及細胞內Caspase-3的活力，抑制凋亡，減輕MPP+損傷的MN9D細胞存活率下降及形態(tài)改變，進而保護MN9D細胞。說明抗氧化劑抗凋亡可能是FUC保護PD細胞模型的作用機制及靶點，進一步深入研究會成為PD有效神經(jīng)保護藥物的研發(fā)基礎。

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（收稿日期：2018-06-11? 本文編輯：張瑜杰）