龍艾虹,梁迪文,羅洪添,楊宇峰,王 慶

1 暨南大學生態(tài)學系,廣州 510632 2 水體富營養(yǎng)化與赤潮防治廣東省教育廳重點實驗室,廣州 510632 3 熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心,廣州 510632

輪蟲是水生食物網(wǎng)的重要組成部分,是研究抗衰老生物學的良好模式生物[6]。褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)隸屬于輪蟲動物門、單巢目、臂尾輪蟲科,具有分布廣、繁殖快、易培養(yǎng)等特點,是咸淡水生態(tài)系統(tǒng)的重要類群。對褶皺臂尾輪蟲的高密度規(guī)?；a(chǎn)已開展了較多研究[7- 8],如大型海藻所含生物活性物質能促進褶皺臂尾輪蟲生長繁殖、延長其壽命,將對褶皺臂尾輪蟲的規(guī)?；囵B(yǎng)和水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要意義。

大型海藻龍須菜是紅藻門江蘺屬種類,廣泛栽培于中國沿海,大量吸收氮磷等營養(yǎng)鹽,常用于修復富營養(yǎng)海域,具有生長快、生物量大等特點,是工業(yè)瓊膠的重要原料和鮑魚養(yǎng)殖的優(yōu)質餌料,目前正在拓展其在生物醫(yī)藥領域的應用[9-11]。大型海藻含有豐富的蛋白質和高度不飽和脂肪酸,可作為褶皺臂尾輪蟲的潛在食物來源[12]；利用大型海藻龍須菜影響褶皺臂尾輪蟲生長和繁殖的研究未有報道。本文應用正交實驗方法,探討在兩種不同小球藻喂養(yǎng)條件下,不同濃度大型海藻龍須菜提取液對褶皺臂尾輪蟲生命表參數(shù)的影響,以期為尋求最佳培養(yǎng)褶皺臂尾輪蟲路徑提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 輪蟲來源與預培養(yǎng)

實驗前,褶皺臂尾輪蟲在EPA培養(yǎng)基中培養(yǎng),于溫度(25±1)℃、光照時間L∶D=12∶12的自然光照培養(yǎng)箱中保存(光照強度約130 lx)。小球藻分別為普通小球藻(Chlorellavulgaris)和蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa),密度控制在(1.0—2.0)×106個/mL,同樣置于上述培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2 大型海藻龍須菜水溶性抽提液的制備

稱取10 g新鮮龍須菜,加少許蒸餾水研磨成漿,用煮沸消毒過的海水離心3次,得上清液100 mL,此為提取液的原液[13]。再用煮沸過的海水稀釋為不同濃度組：250 mg/L,500 mg/L,750 mg/L,1000 mg/L。

1.3 實驗步驟

將攜帶非混交卵的單個輪蟲挑進塑料孔板,經(jīng)過培養(yǎng)孵化出新一代輪蟲幼體,取剛孵化的輪蟲幼體作為實驗對象,加入不同濃度龍須菜提取液的培養(yǎng)基中,分別投喂普通小球藻和蛋白核小球藻,其濃度分別為1.0×106個/mL和2.0×106個/mL,實驗在光照培養(yǎng)箱中進行,培養(yǎng)條件同上。實驗過程中,每間隔12 h觀察一次,記錄輪蟲產(chǎn)出的幼體數(shù)及存活個數(shù),將新產(chǎn)出的幼體用毛細玻璃管移出。每間隔24 h更換一次培養(yǎng)液、龍須菜抽提液和食物小球藻。實驗設置8個平行,直至所有母體均死亡為止。

1.4 生活史參數(shù)及其計算方法

(1)特定年齡存活率(lx):x年齡組開始時存活個體百分數(shù);

(2)特定年齡繁殖率(mx):x年齡組平均個體所產(chǎn)的雌性后代數(shù),mx=后代數(shù)/(母體數(shù)×24 h);

(3)平均壽命：所有個體平均能活多久的觀察值；

(4)凈生長率(R0)：種群經(jīng)過一個世代后的凈增長率,R0=∑lxmx；

從一收入院開始，我們就給她進行化療。一開始療效挺好，腫瘤有所縮小，但隨著時間的推移，她的病情越來越嚴重，但不管治療效果如何，她都非常信任我，把醫(yī)囑執(zhí)行得很好，和我們溝通起來也很愉快。惡心、嘔吐、腹瀉……這種嚴重的化療毒性反應并沒有讓她和其他患者一樣，對醫(yī)師和治療失去信心。她對她老公說話也是輕聲細語的，充滿了感激。

(5)世代時間：完成一個世代所需要的時間,T=∑lxmx/R0；

1.5 數(shù)據(jù)的處理和分析

采用SPSS統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較(LSD檢驗)分析各濃度組下各組數(shù)據(jù)之間的差異性。以龍須菜抽提液和食物密度作為雙因子,應用SPSS軟件雙因素方差分析的一般模型,比較不同龍須菜抽提液濃度與不同食物密度兩種因素及其交互影響對輪蟲生命表參數(shù)的影響。采用Origin Pro 2016進行作圖。

2 結果

2.1 輪蟲的產(chǎn)卵數(shù)和平均壽命

不同食物濃度下,輪蟲的產(chǎn)卵數(shù)隨著大型海藻龍須菜抽提液濃度的升高而不同；食物濃度1×106個/mL蛋白核小球藻和普通小球藻的實驗組,其大型海藻抽提液濃度組產(chǎn)卵數(shù)顯著高于對照組(P<0.05),并在濃度為750 mg/L達到最高(P<0.05),對比對照組分別增長26%和29.8%；食物濃度為2×106個/mL普通小球藻的實驗組在500 mg/L處達到最高(P<0.05),對比對照組增長15.1%；而食物濃度為2.0×106個/mL蛋白核小球藻實驗組產(chǎn)卵數(shù)與對照組相比未有顯著增多(圖1)。

圖1 大型海藻抽提液對褶皺臂尾輪蟲產(chǎn)卵數(shù)的影響Fig.1 The effects of seaweed extracts on the egg number ofBrachionus plicatilis圖柱字母ab與AB分別表示各處理組間差異顯著(P<0.05)

不同濃度小球藻的實驗組,隨著龍須菜抽提液濃度的提高,平均壽命值呈先上升再下降的趨勢；食物濃度1.0×106個/mL小球藻實驗組的輪蟲平均壽命值在抽提液濃度750 mg/L時達到最高(P<0.05),對比對照組分別增長11.6%和14.2%；食物濃度為2.0×106個/mL蛋白核小球藻實驗組的輪蟲平均壽命值在抽提液濃度為250 mg/L達到最高,而濃度為2.0×106個/mL普通小球藻實驗組則為500 mg/L處最高(P<0.05),對比對照組最大增長分別為10.7%和14.4%(圖2)。

圖2 大型海藻抽提液對褶皺臂尾輪蟲平均壽命的影響Fig.2 The effects of seaweed extracts on the average life span ofBrachionus plicatilis 圖柱字母ab與AB分別表示各處理組間差異顯著(P<0.05)

2.2 輪蟲的生命表參數(shù)統(tǒng)計

不同食物濃度,不同龍須菜抽提液濃度下的存活率開始下降的時間有所不同。濃度1.0×106個/mL蛋白核小球藻以及投喂普通小球藻輪蟲實驗組的存活率結果顯示,對照組在第4天開始下降,實驗組在第6天或以上開始下降(P<0.05)；而食物濃度為2.0×106個/mL蛋白核小球藻則沒有顯示出顯著差異(圖3)。

雙因素方差分析顯示,龍須菜抽提液和不同的小球藻投喂量對輪蟲的生命表統(tǒng)計參數(shù)有不同程度的影響(表1)。其中,食物濃度為1.0×106個/mL的兩種小球藻和2.0×106個/mL普通小球藻實驗組培養(yǎng)條件下,不同濃度龍須菜抽提液對輪蟲凈生長率R0、世代時間T均有顯著影響(P<0.05)；相同濃度龍須菜抽提液條件下,食物濃度為1.0×106個/mL蛋白核小球藻輪蟲的凈生長率R0、世代時間T比食物濃度為2×106個/mL的實驗組高(P<0.05),但食物濃度為2.0×106個/mL蛋白核小球藻實驗組的內稟增長率r相對更高。交互作用分析顯示,主體間效應檢驗到不同濃度的小球藻與龍須菜抽提液均對褶皺臂尾輪蟲具有顯著影響(P=0.01；P<0.05),龍須菜抽提液與小球藻食物的交互作用對褶皺臂尾輪蟲的內稟增長率有顯著影響(P<0.05)。

表1 不同濃度龍須菜抽提液和食物濃度下褶皺臂尾輪蟲的生命表統(tǒng)計參數(shù)

數(shù)據(jù)為平均值±標準差,*表示同一食物濃度下不同龍須菜抽提液濃度與對照組相比有顯著差異(P<0.05)

圖3 大型海藻抽提液對褶皺臂尾輪蟲存活率的影響Fig.3 The effects of seaweed extracts on the survival rate ofBrachionus plicatilis

不同食物濃度下,輪蟲的繁殖率最高值隨著龍須菜抽提液濃度的改變而不同,繁殖率均呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(圖4)。

圖4 大型海藻抽提液對褶皺臂尾輪蟲繁殖率的影響Fig.4 The effects of seaweed extracts on the reproduction rate ofBrachionus plicatilis

3 討論

3.1 食物對輪蟲存活和發(fā)育的影響

輪蟲種群增長被認為受食物水平和溫度等因素的影響[14- 16]。研究顯示,優(yōu)化溫度和藻類食物密度的組合可以提高輪蟲(B.havanaensis)的產(chǎn)卵數(shù),總繁殖率和凈繁殖率以及種群內稟增長率隨著溫度升高而增加,并且通常在任何給定的溫度下,較高的藻類食物水平都會導致這些變量產(chǎn)生較高值[17]。但不同的研究其結果有較大的差異。溫度和斜生柵藻密度對裂足臂尾輪蟲(B.diversicornis)的生活史參數(shù)有不同影響,其中,溫度對輪蟲的生命期望、世代時間、凈生長率和總生殖率均有顯著影響；而食物密度顯著提高了裂足臂尾輪蟲的凈生長率和總生殖率；溫度與食物之間的交互作用并沒有顯著影響輪蟲的生活史參數(shù)[18]。溫度25℃下,較高或較低的食物密度顯著縮短萼花臂尾輪蟲(B.calyciflorus)的平均壽命和世代時間,在3.0×106個/mL的小球藻密度下輪蟲的生命期望和平均壽命最長[19]。但Halbach等認為,投喂蛋白核小球藻的密度為1.0×106個/mL時,萼花臂尾輪蟲的繁殖速度最快,當超過這一食物密度,輪蟲繁殖速度則隨著食物密度的增加而下降[20]。在小球藻濃度為1.0×106個/mL和2.0×106個/mL時,變異臂尾輪蟲(B.variablis)的凈生長率、平均壽命和生命期望最高,高于或低于該密度則顯著降低；此外,食物密度對變異臂尾輪蟲的總繁殖率、世代時間和種群增長率有顯著影響[21]。本實驗的研究結果顯示：食物密度為1.0×106個/mL蛋白核小球藻時,在龍須菜抽提液的交互影響下,褶皺臂尾輪蟲的凈生長率顯著高于食物密度為2.0×106個/mL的實驗組,世代時間相對更長,這與Halbach等的研究結果類似。

除了受單一食物餌料的影響,不同的食物組合對輪蟲的存活與生殖也有顯著影響。李香等發(fā)現(xiàn)蛋白核小球藻與水華魚腥藻組成的混合餌料對萼花臂尾輪蟲的增殖效果有顯著影響,而蛋白核小球藻則是最適培養(yǎng)萼花臂尾輪蟲的單一種類[22]。席貽龍等研究發(fā)現(xiàn),利用橢圓小球藻、尖細柵藻和兩者以1∶1組成的混合藻培養(yǎng)壺狀臂尾輪蟲,輪蟲的繁殖率、產(chǎn)卵率和種群內稟增長率均為小球藻組最高,混合藻組次之,柵藻組最低,三者間具顯著差異[23]。由此可見,小球藻是培養(yǎng)輪蟲最適餌料之一。

3.2 大型海藻對輪蟲存活與生殖的影響

實驗發(fā)現(xiàn),大型海藻龍須菜提取液對輪蟲的產(chǎn)卵數(shù)量以及存活時間有顯著影響。大型海藻具有較高的營養(yǎng)價值,其富含蛋白質、礦物質及多種生物活性物質等,這些特點使得大型海藻具有抗衰老抗氧化活性,可作為飼料添加劑來使用,對經(jīng)濟水生動物的生長具有促進作用[9]。有研究顯示,飼料中添加龍須菜粉能促進凡納濱對蝦的生長和抗應激能力,以海藻作為飼料添加劑,能有效改善飼料的營養(yǎng)結構,提高魚、蝦等水產(chǎn)動物的生產(chǎn)率和飼料利用率[24]。在斑節(jié)對蝦幼蝦飼料中添加2%—4%的裙帶菜能顯著提高對蝦對飼料蛋白質的利用率,促進飼料蛋白質在蝦體內的沉積[25]。在日本對蝦飼料中添加2%的石莼藻粉,對蝦的成活率提高8.69%,增重率提高173%,在飼料中添加3%的紫菜粉,能促進黑鯛幼魚的生長繁殖,改善營養(yǎng)物質的利用率以及整體營養(yǎng)組成[26]。殷旭旺等[27]研究了孔石莼、角叉菜、裙帶菜等3種大型海藻干粉混合飼料對刺參幼參的影響,結果表明混合了孔石莼的飼料對刺參的促進作用最好。

本實驗結果顯示,大型海藻龍須菜提取液可顯著延長輪蟲的壽命。大型海藻富含多種結構多樣的小分子生物活性物質,這些活性物質具有抗衰老等相關特性,其中紅藻目前至少鑒定出42種新結構活性物質[3]。Snare等研究發(fā)現(xiàn)3種大型海藻的提取液可延長臂尾輪蟲(B.manjavac)壽命的9%—14%,起主要作用的是提取液中的脂類,如二十碳飽和脂肪酸、十八酸丁酯和棕櫚酸等[5]。大型海藻孔石莼、裙帶菜和角叉菜是一種適合褶皺臂尾輪蟲大規(guī)模培養(yǎng)的替代食物,這些大型海藻的碎屑分別與微擬球藻(Nannochloropsissp.)混合喂養(yǎng)褶皺臂尾輪蟲,獲得了更高輪蟲種群密度和種群增長率,其中,以孔石莼碎屑混合投喂的褶皺臂尾輪蟲,其體內游離氨基酸、多不飽和脂肪酸和二十二碳六烯酸(DHA)含量最高[28]。

本實驗中,利用不同濃度大型海藻龍須菜抽提液對褶皺臂尾輪蟲進行培養(yǎng),結果表明,龍須菜抽提液對輪蟲的存活與生殖均有影響。隨著龍須菜抽提液濃度的提高,褶皺臂尾輪蟲的產(chǎn)卵數(shù)以及平均壽命相應提高,與對照組相比,不同濃度龍須菜抽提液培養(yǎng)的輪蟲凈生長率、平均壽命以及內稟增長率均表現(xiàn)出顯著差異。研究結果表明大型海藻龍須菜抽提液對褶皺臂尾輪蟲生長與生殖具有一定的促進作用,為優(yōu)化該輪蟲的大規(guī)模培養(yǎng)提供了參考。