段繼惠，楊磊，穆紅，唐志琴

(天津市第一中心醫(yī)院，天津300190)

宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1,2]。鱗狀細(xì)胞癌是宮頸癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類型[3]。病灶內(nèi)癌細(xì)胞的增殖和凋亡涉及多基因的異常表達(dá)，探討宮頸癌的分子調(diào)控機(jī)制以獲取有效的治療靶點(diǎn)，是改善宮頸癌患者預(yù)后的重要研究課題。人類Zest同源增強(qiáng)子(EZH2)基因是多梳家族(PcG)蛋白家族成員之一，它通過(guò)特異性地使基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3賴氨酸27發(fā)生甲基化，參與眾多基因的轉(zhuǎn)錄沉默。研究表明，EZH2在多種惡性腫瘤中表達(dá)水平增高[4,5]。在腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域，為提高抗癌療效的特異性，分子靶向治療已引起廣泛關(guān)注。3-去氮腺嘌呤(DZNep)是一種能夠使染色體重塑的化合物，有研究表明，DZNep可以抑制EZH2的表達(dá)[6～8]。2017年10月～2018年6月，我們對(duì)宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行DZNep干預(yù)，觀察抑制EZH2表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為以EZH2為靶點(diǎn)的宮頸癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與材料 根據(jù)本課題組前期研究所得Western blotting結(jié)果，選擇EZH2蛋白表達(dá)較高的人宮頸癌細(xì)胞系Siha和C33A細(xì)胞，Siha細(xì)胞由天津市第一中心醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，C33A購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；四甲基噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自天津萊博生物有限公司；Annexi Ⅴ細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒；Western blotting相關(guān)試劑及主要抗體購(gòu)自上海碧云天生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Siha和C33A細(xì)胞常規(guī)置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(加青霉素100 U/mL及鏈霉素100 μg/mL)，在37 ℃、5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰酶溶液消化，傳代，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 兩種細(xì)胞DZNep半數(shù)抑制濃度(IC50)值的確定 采用MTT法。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Siha和C33A細(xì)胞分別接種于96孔板。每孔細(xì)胞1×105個(gè)，培養(yǎng)12 h后分別加入梯度濃度的DZNep(0、0.2、0.6、1、2、4、6、8、10 μmol/L)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)對(duì)照孔(不加DZNep)和空白對(duì)照孔(DMEM+MTT+ DMSO)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，全自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度值，波長(zhǎng)設(shè)定為490 nm，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。MTT結(jié)果顯示，隨著DZNEP濃度的增加，Siha和C33A細(xì)胞吸光度值均逐漸減小，有增殖活力的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞的抑制率逐漸增加，Siha和C33A細(xì)胞的IC50分別為6 μmol/L和4 μmol/L，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀。宮頸癌細(xì)胞株以5×105/孔的密度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至瓶底的80%，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)棄去原培養(yǎng)液，加入DZNep處理。分為DMSO組、1/2 IC50組和IC50組，分別以DZNep終濃度0、3、6 μmol/L處理Siha細(xì)胞各組，以0、2、4 μmol/L處理C33A細(xì)胞各組。培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，用1×buffer重懸細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和1 μL PI(100 mg/L)，室溫避光放置15 min，再加入400 μL 1×buffer，混勻后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5 EZH2及相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)EZH2蛋白、抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-X基因長(zhǎng)片段(Bcl-xL)、促凋亡蛋白Bcl-2家族細(xì)胞凋亡相互作用因子(Bim)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表達(dá)。將細(xì)胞分為DMSO組、1/2 IC50組和IC50組。取細(xì)胞培養(yǎng)懸液加入裂解液，提取細(xì)胞蛋白并進(jìn)行定量。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，分別用稀釋度1∶400的相應(yīng)一抗 (EZH2、Bcl-xL、Bim、Caspase-3)，4 ℃過(guò)夜后加堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的相應(yīng)二抗IgG(1∶5 000)室溫下孵育120 min，以β -肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參分析目的蛋白的表達(dá)，利用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色條帶顯色，X線膠片曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，Quantity One軟件計(jì)算吸光度積分值分析算出相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞早期凋亡率比較 在Siha、C33A細(xì)胞中，1/2 IC50組、IC50組早期凋亡率均高于DMSO組(P均<0.05)，IC50組早期凋亡率均高于1/2 IC50組(P均<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

2.2 Siha和C33A細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)比較 在Siha、C33A細(xì)胞中，IC50組EZH2蛋白表達(dá)均低于1/2 IC50組、DMSO組(P均<0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

2.3 Siha和C33A細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 在Siha、C33A細(xì)胞中，IC50組Bcl-xL蛋白表達(dá)均低于1/2 IC50組、DMSO組，Bim和Caspase-3蛋白表達(dá)均高于1/2 IC50組、DMSO組(P均<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

注：A和D為DMSO組；B和E為1/2 IC50組；C和F為IC50組。

表1 Siha、C33A細(xì)胞中各組細(xì)胞早期凋亡率及EZH2蛋白 表達(dá)比較

注：與DMSO組比較，*P<0.05；與1/2 IC50組比較，﹟P<0.05。

3 討論

EZH2是組成多梳蛋白抑制復(fù)合物多梳蛋白抑制復(fù)合體2(PRC2)的核心亞基，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能有重要作用[9,10]。近年研究顯示，EZH2在宮頸癌組織中異常高表達(dá)，抑制EZH2表達(dá)可延緩腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11,12]。探索以EZH2為靶點(diǎn)的基因治療是近年宮頸癌治療研究的方向之一。

表2 Siha、C33A細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

注：與DMSO組比較，*P<0.05；與1/2 IC50組比較，﹟P<0.05。

DZNep是3-脫氮腺苷類似物，它能誘導(dǎo)PRC2復(fù)合物包括EZH2的降解[13]。研究表明，DZNep具有抗腫瘤活性，對(duì)胃癌、前列腺癌、黑色素瘤中高表達(dá)的EZH2有明顯抑制作用[6,14,15]。EZH2是一種致癌基因，它可以特異性地使組蛋白H3的第27位點(diǎn)的賴氨酸(H3K27)三甲基化(H3K27me3)，從而使下游靶基因沉默，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。DZNep通過(guò)抑制組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[16]。作為EZH2的小分子抑制劑，DZNep對(duì)腫瘤的潛在治療作用備受臨床醫(yī)生的關(guān)注。本研究結(jié)果顯示，在Siha、C33A細(xì)胞中，1/2 IC50組、IC50組早期凋亡率均高于DMSO組，提示DZNep能夠明顯促進(jìn)Siha和C33A細(xì)胞的凋亡，濃度較高時(shí)抑制作用更強(qiáng)；在Siha、C33A細(xì)胞中，IC50組EZH2蛋白表達(dá)均低于1/2 IC50組、DMSO組，提示DZNep能夠明顯抑制EZH2蛋白的表達(dá)水平，而且DZNep的濃度越高，抑制作用越明顯。

抗凋亡是腫瘤細(xì)胞進(jìn)展中普遍存在的特點(diǎn)，因此研究如何促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡可為治療腫瘤提供新的方向和靶點(diǎn)。凋亡信號(hào)的產(chǎn)生來(lái)自于細(xì)胞的不同部位，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞表面的死亡受體，最終由半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族的成員來(lái)完成，其中Caspase-3的活化是凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志[17]。Bcl-xL屬于Bcl-2家族成員，通過(guò)阻止線粒體外膜上Bax/Bak寡聚體的形成來(lái)發(fā)揮其抗凋亡作用[18]；而B(niǎo)cl-2家族的另一成員Bim的作用與Bcl-xL的功能截然相反[19]，具有促凋亡的作用。Bim只含有BH3結(jié)構(gòu)域，它是線粒體凋亡的始動(dòng)者，受到轉(zhuǎn)錄和翻譯后兩個(gè)水平的調(diào)節(jié)?；罨腂im分子移位到線粒體膜，使線粒體外膜上的Bax/Bak活化，膜通透性發(fā)生改變，形成凋亡小體，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，在Siha、C33A細(xì)胞中，IC50組Bcl-xL蛋白表達(dá)均低于1/2 IC50組、DMSO組，Bim和Caspase-3蛋白表達(dá)均高于1/2 IC50組、DMSO組，提示DZNep可使宮頸癌細(xì)胞中Bcl-xL表達(dá)降低，而使Bim和Caspase-3蛋白表達(dá)增高，結(jié)合本研究所得細(xì)胞凋亡率結(jié)果，考慮DZNep可以通過(guò)抑制EZH2的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL表達(dá)并上調(diào)促凋亡蛋白Bim、Caspase-3表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。

注：A和D為 DMSO組；B和E為1/2 IC50組；C和F為IC50組。

本研究結(jié)果表明，利用DZNep靶向下調(diào)宮頸癌細(xì)胞系Siha和C33A中EZH2的表達(dá)后，能夠誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞早期凋亡，其機(jī)制可能與抑制EZH2的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)Bcl-xL蛋白表達(dá)并上調(diào)Bim和Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)，為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。