羅小芳， 陳啟燕， 王 釵， 姜紅宇， 王宗成

(1.湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199； 2.湖南省湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 永州 425199)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)，屬唇形科迷迭香屬植物，原產(chǎn)于歐洲、北非以及地中海沿岸[1]，1981年中國科學(xué)院植物所在我國貴州等地成功進(jìn)行了引種[2]，目前在廣西、貴州、云南、浙江等地廣泛種植[1]。迷迭香含有豐富的抗氧化成分，主要有二萜類、黃酮類、三萜類等化合物[3]，其中二萜類的鼠尾草酸是含量最高、活性最強(qiáng)的脂溶性抗氧化成分[4]，對油脂具有較好的抗氧化活性[5-7]。此外，鼠尾草酸還具有抗癌、抗炎、抑菌、神經(jīng)保護(hù)等藥理活性[8-10]，已被廣泛用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域。目前，鼠尾草酸的提取主要以熱回流法[11]為主，耗時長，得率較低，且鼠尾草酸在較高溫度的溶劑中存在時間較長容易轉(zhuǎn)化為鼠尾草酚[12]，增加后續(xù)純化難度，雖然有在較低溫度下的超聲輔助提取鼠尾草酸的報(bào)道[12-13]，但是提取時間仍較長。因此，尋求一種高效、快速的鼠尾草酸提取方法具有重要意義。超聲破碎提取法通過將發(fā)射超聲波的探頭直接插到混有原料的溶劑中，使原料直接受超聲波的作用，促使原料中的有效成分快速溶于溶劑中，具有操作簡便、工藝周期短、有效成分不被破壞等優(yōu)點(diǎn)[14]。本文以迷迭香葉為原料，研究了鼠尾草酸的超聲破碎提取工藝，并采用Schaal烘箱法研究迷迭香葉中鼠尾草酸對油脂的抗氧化作用，為迷迭香葉的開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

迷迭香葉(市售)。無水乙醇、磷酸、BHT、BHA、抗壞血酸(VC)、一水檸檬酸，分析純；甲醇，色譜純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

JYD-1200L超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，上海之信儀器有限公司；TE124S型電子天平，德國賽多利斯；AHS-370型恒溫烘箱，吳江華東標(biāo)準(zhǔn)烘箱有限公司；RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，長沙泰康儀器有限公司；LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鼠尾草酸的提取

將迷迭香葉放至60℃烘箱干燥2 h，粉碎，過60目篩。精確稱取10.0 g迷迭香葉粉置于250 mL燒杯中，加入一定量的提取溶劑，在一定功率下超聲破碎提取一定時間，提取液抽濾后，準(zhǔn)確測量體積，取約10 mL濾液用0.45 μm的聚偏氟乙烯有機(jī)微孔濾膜過濾后作為高效液相色譜待測樣品溶液。

1.2.2 高效液相色譜分析條件

月旭C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；檢測波長210 nm；流動相A為0.05%的磷酸水溶液，B為甲醇；流速1.0 mL/min；洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取鼠尾草酸標(biāo)準(zhǔn)品11.5 mg，用無水乙醇溶解，并定容至10 mL。分別精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL至10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，取20 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液注入液相色譜儀，采用1.2.2色譜分析條件進(jìn)行測定。以質(zhì)量(x)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程y=303 202x+3 423.6(R2=0.999 9)。

1.2.4 樣品溶液的測定

采用1.2.2色譜分析條件，取20 μL待測樣品溶液注入液相色譜儀進(jìn)行測定，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算樣品溶液中鼠尾草酸的質(zhì)量濃度，再根據(jù)提取液的體積，計(jì)算出提取到的鼠尾草酸的質(zhì)量。參照文獻(xiàn)[11]，采用超聲輔助浸提法反復(fù)提取3次迷迭香葉中的鼠尾草酸，測得10 g迷迭香葉中鼠尾草酸的質(zhì)量為0.308 g。

1.2.5 鼠尾草酸提取率的計(jì)算

1.2.6 鼠尾草酸的純化

參考文獻(xiàn)[15]，將迷迭香葉中鼠尾草酸提取后，采取硅膠層析法進(jìn)行純化。

1.2.7 迷迭香葉中鼠尾草酸抗油脂氧化活性的分析

采用Schaal烘箱法，取50 g食用油置于廣口瓶中，分別加入一定量純化的鼠尾草酸和/或其他抗氧劑，使充分混勻，以無添加的油脂為空白對照，放入(65±1)℃的恒溫烘箱中進(jìn)行誘導(dǎo)強(qiáng)制氧化，每隔3 d檢測樣品的過氧化值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對鼠尾草酸提取效果的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲時間3 min與超聲功率360 W，考察不同料液比對鼠尾草酸提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對迷迭香葉中鼠尾草酸提取率的影響

由圖1可知，當(dāng)料液比從1∶5增加至1∶15時，鼠尾草酸提取率逐漸提高，繼續(xù)增加料液比，鼠尾草酸提取率略有降低。增加料液比可以提高有效成分的擴(kuò)散速度，有助于鼠尾草酸溶出，但當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡時，增加提取劑不會促進(jìn)鼠尾草酸的提取，反而使之后的濃縮更為困難。因此，綜合考慮提取所需的能耗，正交試驗(yàn)選擇料液比為1∶10～1∶20。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對鼠尾草酸提取效果的影響

固定超聲時間3 min、料液比1∶10與超聲功率360 W，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對鼠尾草酸提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對迷迭香葉中鼠尾草酸提取率的影響

由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)從60%增加100%時，鼠尾草酸的提取率逐漸升高，當(dāng)以無水乙醇為溶劑時，鼠尾草酸的提取效果最好。因?yàn)槭笪膊菟崛苡谝掖?，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，溶解度增大，提取率也隨之提高。因此，正交試驗(yàn)選取無水乙醇。

2.1.3 超聲功率對鼠尾草酸提取效果的影響

以無水乙醇為溶劑，固定料液比1∶10與超聲時間3 min，考察不同超聲功率對鼠尾草酸提取率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)超聲功率從120 W增加至480 W時，鼠尾草酸提取率提高，繼續(xù)增加超聲功率，鼠尾草酸的提取率反而下降。增大超聲功率可以提高植物細(xì)胞的破碎度，有助于鼠尾草酸從基質(zhì)中溶出，但超聲功率過高會破壞鼠尾草酸的結(jié)構(gòu)，降低提取率。因此，正交試驗(yàn)選擇超聲功率為360～600 W。

圖3 超聲功率對迷迭香葉中鼠尾草酸提取率的影響

2.1.4 超聲時間對鼠尾草酸提取效果的影響

以無水乙醇為溶劑，固定料液比1∶10與超聲功率360 W，考察不同超聲時間對鼠尾草酸提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲時間對迷迭香葉中鼠尾草酸提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)超聲時間達(dá)到2 min時，鼠尾草酸提取率最高，繼續(xù)延長超聲時間，鼠尾草酸提取率逐漸下降。因此，正交試驗(yàn)的超聲時間為1～3 min。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以鼠尾草酸提取率為指標(biāo)，選取料液比(A)、超聲功率(B)和超聲時間(C)作為考察因素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化迷迭香葉中鼠尾草酸的提取工藝條件，正交試驗(yàn)因素水平見表2，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析見表4。

由表3可知，各因素對鼠尾草酸提取率影響大小依次為C>B>A，即超聲時間>超聲功率>料液比，優(yōu)化工藝組合為A1B3C2。由表4可知，超聲時間對鼠尾草酸提取率的影響顯著，超聲功率和料液比對鼠尾草酸提取率的影響不顯著。最佳工藝條件為料液比1∶10、超聲功率600 W、超聲時間2 min，在此條件下進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，得到鼠尾草酸的平均提取率為93.6%。與文獻(xiàn)[12-13]相比，提取時間大幅縮短。

表2 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 方差分析

注：F0.05=19.000。

2.3 迷迭香葉中鼠尾草酸對油脂的抗氧化作用

2.3.1 迷迭香葉中鼠尾草酸對不同油脂的抗氧化作用

將0.02%的鼠尾草酸分別添加到豬油、菜籽油和花生油中，同時分別以豬油、菜籽油、花生油作空白對照，按Schaal烘箱法測定3～15 d時油脂的過氧化值，研究鼠尾草酸對不同油脂的抗氧化作用。結(jié)果見圖5。

圖5 鼠尾草酸對不同油脂的抗氧化作用

由圖5可知，隨著時間的延長，油樣的過氧化值均有不同程度的上升，但是添加鼠尾草酸的油樣較相應(yīng)的空白油樣過氧化值增長緩慢，而空白油樣過氧化值急劇上升，表明鼠尾草酸對3種油脂的氧化酸敗都有不同程度的抑制作用。

2.3.2 不同添加量的鼠尾草酸對豬油的抗氧化作用

分別在豬油中添加0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%的鼠尾草酸，同時以豬油作空白對照，測定3～15 d時油脂的過氧化值，研究不同添加量鼠尾草酸對油脂的抗氧化作用。結(jié)果見圖6。

圖6 不同添加量的鼠尾草酸對豬油的抗氧化作用

由圖6可知，隨著鼠尾草酸添加量的增大，豬油的過氧化值呈下降趨勢，即其抗氧化效率增強(qiáng)。因此，鼠尾草酸對豬油的抗氧化能力有劑量效應(yīng)的關(guān)系，可以根據(jù)實(shí)際需要控制鼠尾草酸的添加量達(dá)到所需的抗氧化效果。

2.3.3 迷迭香葉中鼠尾草酸與其他抗氧劑對豬油的抗氧化作用

將0.02%鼠尾草酸、0.02%BHT、0.02%BHA、0.02%抗壞血酸、0.02%檸檬酸分別添加至50 g豬油中，同時以豬油作空白對照，測定3～15 d時油脂的過氧化值。結(jié)果見圖7。

圖7 鼠尾草酸與其他抗氧劑對豬油的抗氧化作用

由圖7可知，隨著時間的延長，油樣的過氧化值均有不同程度的上升，但加入抗氧劑后的油樣過氧化值都明顯低于空白對照，且鼠尾草酸樣品試驗(yàn)組總體過氧化值較低，抗氧化效果接近BHT試驗(yàn)組，鼠尾草酸具有比BHA以及檸檬酸更強(qiáng)的抗氧化性。由此看出，鼠尾草酸有較大的開發(fā)潛力。

2.3.4 鼠尾草酸與其他抗氧劑的協(xié)同增效作用

分別取0.02%鼠尾草酸與0.02%BHA、0.02%BHT、0.02%抗壞血酸、0.02%檸檬酸4種復(fù)配物及0.04%鼠尾草酸分別加入到50 g豬油中，并以豬油作空白對照，測定3～15 d時油脂的過氧化值，研究鼠尾草酸與其他抗氧劑的協(xié)同增效作用。結(jié)果見圖8。

圖8 鼠尾草酸與其他抗氧劑的協(xié)同增效作用

由圖8可知，隨著時間的延長，空白油樣過氧化值急劇上升，而添加鼠尾草酸復(fù)配物的油樣明顯低于空白，鼠尾草酸與檸檬酸復(fù)配試驗(yàn)組、鼠尾草酸與抗壞血酸復(fù)配試驗(yàn)組抗氧化效果強(qiáng)于單一鼠尾草酸試驗(yàn)組，對豬油的抗氧化效果由強(qiáng)到弱依次為抗壞血酸+鼠尾草酸>檸檬酸+鼠尾草酸>鼠尾草酸>BHA+鼠尾草酸>BHT+鼠尾草酸。由此可知，有機(jī)酸與抗氧化劑協(xié)同使用可增強(qiáng)其抗氧化功能?？赡苡捎谟袡C(jī)酸與油中某些金屬離子螯合形成金屬鹽，降低了微量金屬離子對油脂氧化的催化能力，從而增加了鼠尾草酸的抗氧化效果[16-17]。

3 結(jié) 論

采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了超聲破碎提取迷迭香葉中鼠尾草酸的提取工藝，得到最佳工藝條件為：以無水乙醇為溶劑，料液比1∶10，超聲功率600 W，超聲時間2 min。在最佳工藝條件下，迷迭香葉中鼠尾草酸的提取率可達(dá)到93.6%?？寡趸钚苑治霰砻鳎缘闳~中鼠尾草酸對花生油、菜籽油和豬油都具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且對油脂的抗氧化能力與鼠尾草酸添加量呈正相關(guān)，鼠尾草酸比BHA以及檸檬酸具有更強(qiáng)的抗油脂氧化活性，且與抗壞血酸和檸檬酸有一定的協(xié)同增效作用。