董家合，劉 輝，張 瑩，何東平,2，胡傳榮,2

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 武漢 430023； 2.國家糧食局糧油資源綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心，武漢 430023)

椰子(CocosnuciferaL.)屬于棕櫚科(Palmaceae)椰子屬(Cocos)，是熱帶地區(qū)主要的木本油料作物和食品能源[1]。椰子油是世界四大木本食用油脂之一。椰子油中中短鏈脂肪酸含量達(dá)80%以上，是低碳脂肪酸的豐富來源[2]。椰子油不僅可作為食用油、食品配料和功能食品，還在藥物、化妝品、洗滌用品和工業(yè)生物燃料等方面有著廣泛的應(yīng)用[3]。

目前，植物油的制備方法有很多，水酶法提油工藝具有出油率高、油脂質(zhì)量好、條件溫和、油易分離、能耗低、副產(chǎn)物可綜合利用等優(yōu)點(diǎn)[4]，近年來已被廣泛應(yīng)用于多種油料中油脂的提取，包括花生[5]、葵花籽[6]、大豆[7]、油菜籽[8]、番茄籽[9]和油茶籽[10]等。水酶法制備的椰子油營養(yǎng)豐富，未經(jīng)高溫處理，無需精煉，避免了精煉過程中添加的化學(xué)試劑造成的食品安全問題，同時也避免了浸提法產(chǎn)生的溶劑殘留，因此稱水酶法制備的椰子油為天然椰子油(VOC)。

椰子的含水量較高，更適合利用水酶法提取椰子油，目前對于水酶法提取椰子油工藝優(yōu)化的研究較少，本文對水酶法提取椰子油的工藝進(jìn)行了研究，進(jìn)一步提高椰子油的提取率，并改善所得椰子油的品質(zhì)，以期為椰子油的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

椰子；纖維素酶(150 000 U/g)、果膠酶(20 000 U/g)、木瓜蛋白酶(100 000 U/g)、半纖維素酶(20 000 U/g)、中性蛋白酶(50 000 U/g)、堿性蛋白酶(40 000 U/g)、乙醚，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-10冷凍干燥機(jī)，RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，DF-101S集熱式磁力攪拌器，PZ-D-5型液體比重天平，TD5A離心機(jī)，DZF-6021真空干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水酶法制備椰子油工藝

1.2.1.1 工藝路線(見圖1)

圖1 水酶法制備椰子油工藝路線

1.2.1.2 實(shí)驗(yàn)操作

成熟的椰子經(jīng)過去除椰衣、椰汁、椰殼、種皮后得到椰肉。準(zhǔn)確稱取500 g新鮮椰肉并切片，按一定的料液比加入水，在攪拌機(jī)中粉碎制成椰漿，在椰漿中加入一定量的酶，在一定溫度下緩慢攪拌一定時間，反應(yīng)完成后在90～95℃下水浴10 min滅酶活，5 000 r/min條件下離心20 min，得到游離油、乳狀液、水解液和椰子粕，乳狀液再次離心，兩次得到的游離油合并，干燥，得椰子油。做3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 椰子油理化指標(biāo)的測定

水分及揮發(fā)物含量，GB/T 5528—2008；酸價，GB/T 5530—2005；過氧化值，GB/T 5538—2005；皂化值，GB/T 5534—2008。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel 2010統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)整理、分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同水解酶對椰子油提取率的影響

在料液比1∶1.5，不同酶各自最適酶解溫度(木瓜蛋白酶60℃、中性蛋白酶40℃、堿性蛋白酶55℃、纖維素酶55℃、半纖維素酶55℃、果膠酶50℃)，酶解時間20 h，加酶量0.20%的條件下，研究不同水解酶對椰子油提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同水解酶對椰子油提取率的影響

植物細(xì)胞的細(xì)胞壁主要由果膠和纖維素、木質(zhì)素等多糖類物質(zhì)組成，其中嵌入一些功能性蛋白質(zhì)，被包裹在其中，油脂通常與其他大分子物質(zhì)結(jié)合構(gòu)成脂多糖、脂蛋白等復(fù)合體。因此，采用酶解工藝可以有效且快速地瓦解細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋出[11]。由圖2可知，加入水解酶后椰子油的提取率明顯提高，其中纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶效果相對較好，但單種酶的作用比較單一，而復(fù)合酶可以相互間產(chǎn)生協(xié)同作用，使酶解的效果達(dá)到最優(yōu)。接下來實(shí)驗(yàn)均使用椰子油提取率較高的纖維素酶和木瓜蛋白酶按照一定的比例混合進(jìn)行。

2.1.2 復(fù)合酶比對椰子油提取率的影響

在料液比1∶1.5，酶解溫度50℃，酶解時間20 h，加酶量0.20%，復(fù)合酶比(纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比)分別為1∶1、1.5∶1、1∶1.5、1∶2的條件下，考察不同復(fù)合酶比對椰子油提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 復(fù)合酶比對椰子油提取率的影響

由圖3可知，將纖維素酶與木瓜蛋白酶按照質(zhì)量比1.5∶1混合，得到的椰子油提取率最優(yōu)，為79.6%。因此，接下來的單因素實(shí)驗(yàn)均按照纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比1.5∶1進(jìn)行。

2.1.3 料液比對椰子油提取率的影響

料液比會影響椰漿的濃度，進(jìn)而影響酶與底物的接觸面積，因此料液比是影響酶促反應(yīng)的主要因素之一。在酶解溫度50℃，酶解時間20 h， 加酶量0.20%，復(fù)合酶比1.5∶1, 料液比分別為1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2的條件下，研究不同料液比對椰子油提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對椰子油提取率的影響

由圖4可知，料液比為1∶1.5時效果最好，椰子油提取率為75.4%。隨著加水量增加，椰子油提取率先升高后降低，分析原因?yàn)閯傞_始加水量少，酶和底物不能充分接觸，導(dǎo)致酶解效率較低，隨著加水量的增加，酶的作用位點(diǎn)和底物能夠充分接觸，酶解效率隨之升高，直到酶解效率達(dá)到最大，加水量過多，酶被稀釋，酶解效率隨之降低。因此，最適料液比為1∶1.5。

2.1.4 酶解溫度對椰子油提取率的影響

在料液比1∶1.5，酶解時間20 h，加酶量0.20%，復(fù)合酶比1.5∶1，酶解溫度分別為35、40、45、50、55℃的條件下，研究不同酶解溫度對椰子油提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 酶解溫度對椰子油提取率的影響

由圖5可知，在酶解溫度為35℃時椰子油提取率最低，隨著酶解溫度的升高椰子油提取率也隨之升高，在酶解溫度為50℃時椰子油提取率達(dá)到最高，為78.3%，繼續(xù)升高酶解溫度，椰子油提取率降低。分析原因?yàn)槊赣凶钸m反應(yīng)溫度，溫度過低或者過高都會抑制酶的活性，使酶解效率降低。因此，最適酶解溫度為50℃。

2.1.5 酶解時間對椰子油提取率的影響

酶和底物的接觸時間直接影響反應(yīng)進(jìn)行得是否徹底，因此酶解時間也是影響椰子油提取率的重要因素之一。在料液比1∶1.5，加酶量0.20%，復(fù)合酶比1.5∶1，酶解溫度50℃，酶解時間分別為12、16、20、24 h的條件下，研究不同酶解時間對椰子油提取率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 酶解時間對椰子油提取率的影響

由圖6可知，隨著酶解時間的延長，椰子油提取率隨之升高，當(dāng)酶解時間為20 h時，椰子油提取率為79.7%，當(dāng)酶解時間為24 h時，椰子油提取率為80.3%，說明隨著酶解時間的延長，椰子油提取率還在緩慢增加，但是隨著酶解時間的延長，椰漿中的蛋白質(zhì)會產(chǎn)生難聞的酸臭味，并且酶解時間的延長會使實(shí)驗(yàn)效率降低，增加實(shí)驗(yàn)成本。因此，最適酶解時間為20 h。

2.1.6 加酶量對椰子油提取率的影響

加酶量會影響酶和底物的接觸面積，進(jìn)而影響酶促反應(yīng)效率，因此加酶量也是影響椰子油提取率的重要因素之一。在料液比1∶1.5，復(fù)合酶比1.5∶1，酶解溫度50℃，酶解時間20 h，加酶量分別為0.15%、0.20%、0.25%、0.30%的條件下，研究不同加酶量對椰子油提取率的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 加酶量對椰子油提取率的影響

由圖7可知，隨著加酶量的增加，椰子油提取率升高，加酶量為0.20%時達(dá)到最高，為82.3%。繼續(xù)增加加酶量，椰子油提取率反而降低，原因是復(fù)合酶濃度過大，酶和底物的接觸位點(diǎn)不能充分暴露出來，導(dǎo)致酶促反應(yīng)效率下降，且酶的成本較高，應(yīng)盡量降低加酶量，因此最適加酶量為0.20%。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，選取料液比、復(fù)合酶比、酶解溫度、加酶量和酶解時間為自變量，以椰子油提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L16(45)正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2中的極差值R可知，5個因素對椰子油提取率影響的程度依次為C(酶解溫度)>E(酶解時間)>B(復(fù)合酶比)>A(料液比)>D(加酶量)。最優(yōu)方案為C3E1B1A3D3或C3E1B1A1D3，即料液比1∶1或1∶2、酶解溫度55℃、加酶量0.25%、酶解時間16 h、復(fù)合酶比1∶1。

將通過正交實(shí)驗(yàn)確定的兩個最優(yōu)方案C3E1B1A3D3和 C3E1B1A1D3進(jìn)一步做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過3次平行實(shí)驗(yàn)，方案C3E1B1A3D3得到的椰子油提取率高于方案C3E1B1A1D3，考慮椰子油提取率以及經(jīng)濟(jì)成本，方案C3E1B1A3D3被確定為最優(yōu)方案。經(jīng)過3次平行實(shí)驗(yàn)，利用最優(yōu)方案得到的椰子油提取率分別為82.9%、83.1%、83.5%，平均提取率為83.2%。所以水酶法提取椰子油的最佳工藝條件為料液比1∶1、酶解溫度55℃、加酶量0.25%、酶解時間16 h，復(fù)合酶比1∶1。

2.3 椰子油的理化指標(biāo)

對最佳條件下提取的椰子油的理化指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 椰子油的理化指標(biāo)

由表3可知，通過水酶法提取的椰子油酸價(KOH)和過氧化值分別為0.56 mg/g和0.36 mmol/kg，均優(yōu)于行標(biāo)NY/T 230—2006。

3 結(jié) 論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，得到水酶法提取椰子油的最佳工藝條件為料液比1∶1、復(fù)合酶比(纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比)1∶1、酶解溫度55℃、加酶量0.25%、酶解時間16 h，在此條件下椰子油提取率可達(dá)83.2%。水酶法制備的椰子油酸價(KOH)和過氧化值分別為0.56 mg/g和0.36 mmol/kg，均優(yōu)于行標(biāo)NY/T 230—2006。