張梓桑，張薪茹，張莊，李光宇，張勁松，杜榮增

心房顫動（房顫）是臨床上最常見、治療上最具挑戰(zhàn)性的快速性心律失常[1]，其具有高致殘率、高病死率、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)[2]。近年來，房顫已成為一個全球公共衛(wèi)生問題。房顫的發(fā)病率不斷提高，預(yù)計到2050 年，房顫患者人數(shù)將達(dá)到7 200 萬，其中290 萬有發(fā)生房顫相關(guān)卒中的風(fēng)險[3-5]。近期研究發(fā)現(xiàn)，β3-腎上腺素受體（AR）表達(dá)水平在房顫犬模型中明顯升高，且激動β3-AR 可導(dǎo)致心房肌細(xì)胞凋亡以及間質(zhì)纖維化進(jìn)一步加劇，相反，使用β3-AR拮抗劑可抑制心房重構(gòu)[6]。雖然已有基礎(chǔ)研究報道β3-AR 與動物房顫模型存在相關(guān)性，但β3-AR 在房顫患者中的表達(dá)變化卻鮮有報道。本研究通過比較健康對照受試者與房顫患者外周血淋巴細(xì)胞β3-AR的表達(dá)水平，旨在分析β3-AR 表達(dá)水平與房顫已知影響因素的相關(guān)性，了解其對房顫的預(yù)測價值，為房顫治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 資料與方法

研究對象：選取2017 年6 月至2018 年7 月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院管內(nèi)科住院的98 例房顫患者作為房顫組，包括35 例陣發(fā)性房顫患者、33 例持續(xù)性房顫患者和30 例永久性房顫患者。另外選擇門診健康體檢者31 例作為對照組。房顫根據(jù)2016 年歐洲房顫管理指南[7]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。陣發(fā)性房顫：自行終止，大多數(shù)持續(xù)時間在48 小時內(nèi)；持續(xù)性房顫：持續(xù)時間超過7 天或使用電復(fù)律、藥物復(fù)律；永久性房顫：不能轉(zhuǎn)復(fù)為竇性心律或在轉(zhuǎn)復(fù)后24 小時內(nèi)復(fù)發(fā)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）紐約心臟協(xié)會心功能分級Ⅲ或Ⅳ級；（2）左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）＜50%；（3）近期（6 個月內(nèi)）發(fā)生血栓栓塞的患者；（4）風(fēng)濕性心臟病患者；（5）心肌病患者；（6）甲亢患者；（7）控制不良的高血壓或糖尿病患者；（8）細(xì)菌感染或病毒感染患者。所有受試者均知情同意，該研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審查通過。

研究方法：比較兩組受試者以及不同類型房顫患者的一般臨床資料、生化指標(biāo)、主要心臟結(jié)構(gòu)功能指標(biāo)、β3-AR 信使核糖核酸（mRNA）表達(dá)水平，評估房顫患者β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平與房顫潛在影響因素的相關(guān)性及β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平對心房顫動預(yù)測價值。

一般臨床資料收集和心臟結(jié)構(gòu)功能檢查：收集兩組受試者包括病史、吸煙史和飲酒史等在內(nèi)的基本臨床資料。經(jīng)全自動血液生化分析儀獲取兩組受試者血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、載脂蛋白A（ApoA）、載脂蛋白B（ApoB）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、血肌酐水平。經(jīng)超聲科專人對兩組受試者進(jìn)行超聲心動圖檢查，獲取左心房內(nèi)徑（LAD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、LVEF 和肺動脈壓力（PAP）等指標(biāo)數(shù)據(jù)。比較兩組受試者上述指標(biāo)的差異。

試劑、儀器及β3-AR 的引物：淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Paque Plus（通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，美國）、熒光實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑盒（TaKaRa公司，日本）、SYBR?Premix Ex Taq?（TaKaRa 公司，日本）、LightCycler?96 實(shí)時熒光定量PCR 儀（賽默飛世爾科技公司，美國）。β3-AR、β 肌動蛋白基因引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計合成。β3-AR、β 肌動蛋白基因引物序列見表1。引物合成后用焦碳酸二乙酯水溶解，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

外周血淋巴細(xì)胞分離：所有受試者入院后空腹于肘靜脈處予肝素抗凝管抽取血5 ml,加入等體積的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）稀釋后充分混勻，再于另一試管中加入與稀釋抗凝血等體積的淋巴細(xì)胞分離液，用滴管沿管壁緩慢將其加于分離液面上，始終保持兩液面界面清晰，水平離心1 800 r/min，共35 min（15℃）。吸出中上層液面處的白色云霧狀淋巴細(xì)胞，加入4～5 倍體積PBS 液混勻，水平離心1 500 r/min，每次7 min，離心2 次（4℃）。本過程均于采血后3 h 內(nèi)完成。

表1 β3 腎上腺素受體和β 肌動蛋白基因的引物序列及擴(kuò)增長度

總核糖核酸（RNA）提取及互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）合成：TRIZOL 法提取分離得到的淋巴細(xì)胞總RNA；使用紫外分光光度計測定RNA 濃度及純度，要求所有樣本的吸光度（OD）260/280 處于1.8～2.0的范圍內(nèi)。cDNA 的合成參照TaKaRa 公司試劑盒說明書，所得cDNA 存放于-20℃冰箱備用。

熒光實(shí)時定量PCR 檢測β3-AR mRNA 的表達(dá)水平：PCR 反應(yīng)在25 μl 反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件：95℃ 6 min；95℃ 12 s；62℃ 40 s，循環(huán)40 次，組內(nèi)重復(fù)3 次取平均值，以ct 值表示，β3-AR 的相對表達(dá)量用2-ΔΔct表示。Δct 和ΔΔct 值通過以下公式計算：Δct=ctβ3-AR-ctβ肌動蛋白和ΔΔct=Δct房顫組-Δct對照組。將對照組β3-AR 表達(dá)量的測量值設(shè)定為1.00±0.00，房顫組數(shù)據(jù)與之進(jìn)行比較，得到相對表達(dá)量。

統(tǒng)計學(xué)方法：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。如果連續(xù)變量呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。如果連續(xù)變量非正態(tài)分布，以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較則采用非參數(shù)Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。多組間均數(shù)比較采用ANOVA 方差分析。分類變量采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。用受試者工作特征（ROC）曲線分析β3-AR 表達(dá)水平對房顫的預(yù)測價值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組受試者的一般臨床資料、生化指標(biāo)及主要心臟結(jié)構(gòu)功能指標(biāo)比較（表2）：房顫組與對照組在性別、年齡、吸煙史、飲酒史、糖尿病病史及血清TC、TG、ApoA、ApoB、HDL-C、血肌酐水平、LVIDd 等方面的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0.05）；兩組間高血壓和冠心病患者比例差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05）。與對照組相比，房顫組的血清LDL-C、CRP 水平升高，LAD 增大，而LVEF 降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05）。

不同類型房顫患者的一般臨床資料、生化指標(biāo)及主要心臟結(jié)構(gòu)功能指標(biāo)比較（表3）：陣發(fā)性房顫、持續(xù)性房顫和永久性房顫患者的LAD、LVEF、PAP和血清CRP 水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05），其余資料和指標(biāo)上的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0.05）。

兩組受試者β3-AR mRNA 表達(dá)水平比較：房顫組的β3-AR mRNA 表達(dá)水平明顯高于對照組，相對表達(dá)水平為3.16±2.50，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著房顫持續(xù)時間越長，陣發(fā)性房顫、持續(xù)性房顫和永久性房顫患者的β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平依次升高[依次為1.90±0.96、2.92±1.45、4.89±3.54]，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05）。

房顫患者β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平與房顫潛在影響因素的相關(guān)性分析（表4）：Pearson 相關(guān)分析顯示，房顫患者β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平與LAD 呈正相關(guān)（r=0.314，P＜0.05）。偏相關(guān)分析表明，調(diào)整性別、年齡、高血壓等因素后，房顫患者β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平仍與LAD 呈正相關(guān)（r=0.256，P＜0.05）。

多因素Logistic 回歸分析及 ROC 曲線分析（表5、圖1）：對兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的LAD、LVEF、CRP、LDL、β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析后發(fā)現(xiàn)，LAD（OR=1.326，95%CI：1.012～1.431，P=0.036）、CRP（OR=3.581，95%CI：1.670～7.676，P=0.001）、β3-AR mRNA 相對 表 達(dá) 水 平（OR=16.644，95%CI：1.106～250.503，P=0.027）為房顫的獨(dú)立預(yù)測因素。ROC 曲線分析表明，β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平預(yù)測房顫的曲線下面積為0.734（95%CI：0.639～0.829，P＜0.05）。

表2 兩組受試者的一般臨床資料、生化指標(biāo)和及主要心臟結(jié)構(gòu)功能指標(biāo)比較

表2 兩組受試者的一般臨床資料、生化指標(biāo)和及主要心臟結(jié)構(gòu)功能指標(biāo)比較

注：LVIDd：左心室舒張末期內(nèi)徑；LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù)；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇。*：非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示。1 mmHg=0.133 kPa

項(xiàng)目 對照組 (n=31) 房顫組 (n=98) P 值年齡 (歲) 58.45±9.95 63.93±7.64 0.054性別 (男/女) 17/14 52/46 0.863吸煙史[例 (%)]9 (29.03) 22 (22.45) 0.455飲酒史[例 (%)]14 (45.16) 28 (28.57) 0.086高血壓[例 (%)]0 (0) 28 (28.57) 0.001冠心病[例 (%)]0 (0) 17 (17.35) 0.013糖尿病[例 (%)]0 (0) 9 (9.18) 0.080左心房內(nèi)徑 (mm) 34.32±4.16 45.70±6.88 0.005肺動脈壓力 (mmHg) 28.16±5.29 31.05±4.27 0.139甘油三酯 (mmol/L) 1.15±0.47 1.32±0.42 0.483 LVIDd (mm)* 41 (9.00) 41 (8.25) 0.996 LVEF (%)* 60 (9.00) 54 (6.00) 0.000總膽固醇 (mmol/L)* 3.93 (1.90) 4.09 (1.58) 0.482載脂蛋白A (mmol/L)* 1.33 (0.43) 1.30 (0.44) 0.591載脂蛋白B (mmol/L)* 0.81 (0.25) 0.82 (0.35) 0.565 LDL-C (mmol/L)* 2.28 (1.56) 2.96 (1.90) 0.002 HDL-C (mmol/L)* 1.29 (0.63) 1.33 (0.72) 0.507 C 反應(yīng)蛋白 (mg/L)* 1.29 (1.04) 5.15 (2.80) 0.000血肌酐 (μmol/L)* 62.70 (28.30) 64.45 (25.83) 0.297

表3 不同類型心房顫動患者一般臨床資料、生化指標(biāo)及主要心臟結(jié)構(gòu)功能指標(biāo)比較（s）

表3 不同類型心房顫動患者一般臨床資料、生化指標(biāo)及主要心臟結(jié)構(gòu)功能指標(biāo)比較（s）

注：LAD：左心房內(nèi)徑；LVIDd：左心室舒張末期內(nèi)徑；LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù)；PAP：肺動脈壓力；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；CRP：C 反應(yīng)蛋白。1 mmHg=0.133 kPa

項(xiàng)目 陣發(fā)性心房顫動患者 (n=35) 持續(xù)性心房顫動患者 (n=33) 永久性心房顫動患者 (n=30) P 值性別 (男/女, 例) 16/19 18/15 18/12 0.505年齡 (歲) 62.11±8.64 63.52±6.87 66.50±6.84 0.063吸煙史[例 (%)]9 (25.71) 7 (21.21) 6 (20.00) 0.841飲酒史[例 (%)]10 (28.57) 12 (36.36) 9 (30.00) 0.767高血壓[例 (%)]8 (22.86) 10 (30.30) 10 (33.33) 0.624冠心病[例 (%)]6 (17.14) 6 (18.18) 5 (16.67) 0.987糖尿病[例 (%)]3 (8.57) 2 (6.06) 4 (13.33) 0.600 LAD (mm) 39.57±5.15 45.76±4.07 52.80±3.40 0.000 LVIDd (mm) 42.03±5.49 42.39±5.50 43.57±4.90 0.489 LVEF (%) 57.66±4.87 54.55±2.97 51.40±2.53 0.000 PAP (mmHg) 28.57±4.05 32.48±3.78 32.37±3.81 0.000總膽固醇 (mmol/L) 4.18±0.88 4.19±0.82 3.86±1.00 0.245甘油三酯 (mmol/L) 1.33±0.39 1.42±0.46 1.20±0.41 0.128載脂蛋白A (mmol/L) 1.21±0.25 1.36±0.24 1.28±0.33 0.071載脂蛋白B (mmol/L) 0.87±0.25 0.80±0.21 0.87±0.23 0.331 LDL-C (mmol/L) 2.96±1.01 2.88±0.96 3.06±1.27 0.792 HDL-C (mmol/L) 1.34±0.54 1.52±0.39 1.35±0.50 0.256 CRP (mg/L) 4.26±1.81 5.88±2.46 6.46±2.44 0.000血肌酐 (μmol/L) 64.60±20.90 68.17±22.61 70.10±22.78 0.594

表4 心房顫動患者β3 腎上腺素受體 mRNA 相對表達(dá)水平與心房顫動潛在影響因素的相關(guān)性分析

表5 心房顫動潛在預(yù)測因素的多因素Logistic 回歸分析

圖1 β3 腎上腺素受體mRNA 相對表達(dá)水平對心房顫動預(yù)測價值的受試者工作特征曲線分析

3 討論

房顫是風(fēng)濕性心臟瓣膜病、冠心病、高血壓、先天性心臟病等多種心血管疾病的常見臨床表現(xiàn)[8]。房顫導(dǎo)致心房血流不規(guī)則，形成血栓，最終發(fā)生腦卒中或心力衰竭等惡性心腦血管事件，嚴(yán)重危害人類健康[9-10]。在心力衰竭患者中，合并房顫者死亡率明顯上升[11]。目前房顫治療效果不理想，因此房顫的預(yù)防和治療一直是心血管領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。

本研究結(jié)果表明，不同類型房顫患者的LAD、LVEF、PAP、CRP 水平有明顯差異。如果房顫持續(xù)存在，心房結(jié)構(gòu)將發(fā)生不可逆的損壞，導(dǎo)致左心功能下降，表現(xiàn)為LAD 增大，LVEF 降低，這也再次驗(yàn)證了木胡牙提等[12]的研究結(jié)果。

在房顫的發(fā)生與維持過程中，心房電、結(jié)構(gòu)和代謝會發(fā)生一系列顯著的改變[13-14]，這些改變反過來又促進(jìn)房顫的發(fā)展和自我維持，造成惡性循環(huán)[15]。Wang 等[16]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β3-AR 在犬房顫模型中的表達(dá)上調(diào)，隨后誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）解偶聯(lián)，一氧化氮產(chǎn)生減少，氧化應(yīng)激進(jìn)一步加重，最終導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)。已有實(shí)驗(yàn)證明，iNOS 與炎癥和氧化應(yīng)激密切相關(guān)，而炎癥和氧化應(yīng)激都參與房顫患者的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者的血清CRP 水平較對照組顯著升高，驗(yàn)證了炎癥參與房顫的發(fā)生。

β3-AR 是具有7 個跨膜結(jié)構(gòu)域的G 蛋白偶聯(lián)受體。隨著β3-AR 與心血管疾病的研究逐漸深入，目前已有許多研究證明β3-AR 與動脈粥樣硬化和心力衰竭有關(guān)[18-21]。Dong 等[22]在兔房顫模型中通過激動β3-AR 發(fā)現(xiàn)，兔心臟線粒體功能受損，心房有效不應(yīng)期縮短，房顫誘導(dǎo)率升高，β3-AR 激動后通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ 共激活因子1α（PGC-1α）/核呼吸因子1（NRF-1）/線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（Tfam）信號通路促進(jìn)心房代謝重構(gòu)。Yu 等[23]在兔房顫模型中發(fā)現(xiàn)，激動β3-AR可減少L 型鈣通道亞型以及增加內(nèi)向整流鉀電流（IK1）和瞬時外向鉀電流（Ito），心房電重構(gòu)加劇，這可能是縮短心房肌細(xì)胞動作電位持續(xù)時間的潛在機(jī)制。此外，Liu 等[24]在房顫兔模型中發(fā)現(xiàn)β3-AR 被激活，能量代謝相關(guān)蛋白被破壞，拮抗β3-AR 則能夠通過過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）/ 過氧化物酶體增殖物激活受體γ 共激活因子1α（PGC-1）途徑抑制房顫誘導(dǎo)的代謝相關(guān)蛋白受損。

本研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平較健康體檢者顯著升高，并且與LAD 呈正相關(guān)；校正各種房顫潛在相關(guān)危險因素后，β3-AR mRNA相對表達(dá)水平仍與LAD 呈正相關(guān)；而且隨著房顫持續(xù)時間延長，β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平升高。以上結(jié)果提示，β3-AR 可能參與了心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)。但β3-AR 參與房顫患者的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)及電重構(gòu)的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本研究表明，β3-AR mRNA 相對、表達(dá)水平LAD、CRP 是房顫的獨(dú)立危險因素，ROC曲線分析顯示β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平預(yù)測房顫的曲線下面積為0.734，提示β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平預(yù)測房顫的準(zhǔn)確性較高，可作為房顫發(fā)生和維持的預(yù)測因子。然而，患者存在不同的基礎(chǔ)疾病以及患者個體間存在差異，這些差異是否會對結(jié)果產(chǎn)生影響尚不清楚。

本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于，我們用淋巴細(xì)胞代替心房組織，減少了患者所受的創(chuàng)傷，更便于臨床研究；本研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者外周血淋巴細(xì)胞中β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平升高，外周血淋巴細(xì)胞中β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平可考慮作為房顫診斷及風(fēng)險評估的新指標(biāo)，未來有可能成為房顫診治的新靶點(diǎn)。

本研究仍存在一些局限性。首先，入選患者病例數(shù)相對較少，不能代表所有房顫患者；其次，研究時間較短，患者不同房顫類型的轉(zhuǎn)變以及房顫患者的不同基礎(chǔ)疾病對β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平可能會產(chǎn)生影響；另外，本研究未驗(yàn)證β3-AR在房顫發(fā)生、發(fā)展中的病理機(jī)制，也沒有研究β1-AR、β2-AR、β3-AR 在房顫發(fā)生、發(fā)展中的相互作用，因?yàn)檫@三種類型的β-AR 都在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮作用。

綜上所述，我們的研究表明，房顫患者外周血淋巴細(xì)胞中β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平升高，并且與LAD 大小及房顫持續(xù)時間密切相關(guān)，外周血淋巴細(xì)胞β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平可能是評估房顫發(fā)生風(fēng)險的一個預(yù)測指標(biāo)。未來還需要開展更大規(guī)模、隨訪時間更長的研究來驗(yàn)證；另外，還需進(jìn)一步開展研究來驗(yàn)證是否可以通過降低β3-AR mRNA 相對表達(dá)水平的干預(yù)措施來減少房顫的發(fā)生以及逆轉(zhuǎn)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)。相信未來隨著對β3-AR 更深入的探索，房顫的病因及發(fā)病機(jī)制會進(jìn)一步明確，從而為房顫的診療提供新思路。