趙志新, 王 通

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

三萜皂苷是植物界中一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，具有多種生物活性，其可增強(qiáng)植物抗病、抗蟲害的能力，同時(shí)還具有抗炎、抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、降低膽固醇、保肝等作用[1]。目前人們已較為明確地認(rèn)識(shí)了三萜皂苷的合成途徑，第一步先通過(guò)甲羥戊酸等途徑生成異戊二烯焦磷酸，再經(jīng)過(guò)催化酶鯊烯環(huán)氧酶等的催化，生成2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶，環(huán)化形成三萜類骨架，然后通過(guò)細(xì)胞色素p450、糖基轉(zhuǎn)移酶、β-糖苷酶的修飾作用，最后形成糖苷化合物-三萜皂苷[2]。糖基轉(zhuǎn)移酶作為三萜皂苷生物合成的最后一步，其機(jī)理及代謝調(diào)控機(jī)制已深入到分子水平，因此為在分子水平研究藥用植物中三萜皂苷生物合成機(jī)理起到了重要作用[3]。

糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyltransferase, GT)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和代謝工程應(yīng)用方面起著重要作用，催化植物次生代謝物合成[4]。糖基轉(zhuǎn)移酶具有多種生物活性, 包括參與植物次生代謝、脫毒反應(yīng)、激素平衡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和防御反應(yīng)等[5]。糖基轉(zhuǎn)移酶在植物次生代謝過(guò)程晚期對(duì)底物選擇靈活，當(dāng)進(jìn)化趨勢(shì)變化或外界環(huán)境變化時(shí)，可使植物能夠較快適應(yīng)不同底物。最近研究顯示，植物糖基轉(zhuǎn)移酶有2個(gè)羅斯曼折疊(Rossmann fold，βαβ結(jié)構(gòu))，在N末端是受體結(jié)合區(qū)，C末端為活性供體結(jié)合區(qū)；同時(shí)該結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出C末端保守區(qū)的功能，以及特定氨基酸殘基合成的結(jié)合糖供體的口袋結(jié)構(gòu)[6]。

筆者研究利用生物信息學(xué)工具，首先搜集植物中已知的糖基轉(zhuǎn)移酶序列，然后使用生物信息學(xué)工具對(duì)其理化性質(zhì)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行分析，為以后研究糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白特性提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

查找植物糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)文獻(xiàn)，并搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，下載已收錄的植物糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列，共獲得以下16種植物(見(jiàn)表1)。

1.2 方法

使用在線分析軟件ProtParam分析糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的理化性質(zhì)；SignalP4.1Server在線工具分析糖基轉(zhuǎn)移酶序列中包含的信號(hào)肽；SOPMA在線工具分析糖基轉(zhuǎn)移酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)(詳細(xì)見(jiàn)表2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列組成和理化性質(zhì)分析

使用在線分析軟件ProtParam分析16種植物糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的組成和理化性質(zhì)(見(jiàn)表3)。

表1 植物糖基轉(zhuǎn)移酶GenBank登錄號(hào)及所屬科

表2 糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白特性分析工具及網(wǎng)址

表3 糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的組成和理化性質(zhì)

續(xù)表3 糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的組成和理化性質(zhì)

從表3中可以看出，這16種植物的基因全長(zhǎng)均在1 000 bp到2 000 bp之間，變異較??；氨基酸數(shù)目大部分在450到500之間，除了薔薇(337)、白蘇子(447)、天山雪蓮(515)和刺五加(608)；原子數(shù)除刺五加(9427)和薔薇(5154)外，均為7 000左右；分子量除薔薇外(36762.3)，都在50 000至67 000之間；滇牡丹pI值為7.22，石榴為6.55，其余植物均小于6，顯示糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸大多為酸性氨基酸；不穩(wěn)定指數(shù)在40左右，桉樹、北柴胡、滇牡丹、蒺藜苜蓿、毛白楊、七彩虹葉、薔薇和紅景天糖基轉(zhuǎn)移酶屬于穩(wěn)定類蛋白，其余為不穩(wěn)定類蛋白；所選植物的糖基轉(zhuǎn)移酶序列中含量最豐富的氨基酸是Leu、Val、Ser、Gly、Glu，而Sec和Pyl則是所有植物序列中均不含有的氨基酸；脂肪指數(shù)除蒺藜苜蓿(101.63)和野葛(80.86)外，均在90左右。

2.2 糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)信號(hào)肽的預(yù)測(cè)分析

使用SignalP4.1Server在線工具對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶序列中包含的信號(hào)肽進(jìn)行分析，圖1和圖2分別為紅景天和三七的分析結(jié)果。

圖1 紅景天糖基轉(zhuǎn)移酶的信號(hào)肽分析結(jié)果

圖2 三七糖基轉(zhuǎn)移酶的信號(hào)肽分析結(jié)果

圖中每個(gè)位置的氨基酸對(duì)應(yīng)一個(gè)S值，若S值較高表明該區(qū)域可能有信號(hào)肽；C值是剪切位點(diǎn)值，在剪切位點(diǎn)處C值最高；Y值是在不只有一個(gè)較高C值時(shí)，綜合考慮S值和C值的一個(gè)參

數(shù)；粉色的虛橫線為閾值線(Threshold value)，在該線上方表明具有顯著性。由圖1和圖2可以看出，紅景天的糖基轉(zhuǎn)移酶序列40-50位置之間可能含有信號(hào)肽，而三七的糖基轉(zhuǎn)移酶序列則不存在信號(hào)肽。同時(shí)從圖1中可以看出，紅景天的Y值比較低，但S值較高；而三七的S值和Y值均比較低，因此可以推測(cè)三七的糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)核糖體合成之后，生成的蛋白屬于非分泌蛋白。除過(guò)紅景天的糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白經(jīng)核糖體生成的蛋白可能屬于分泌蛋白外，其余14種植物信號(hào)肽分析結(jié)果到與三七相近，因此沒(méi)有展示。

2.3 糖基轉(zhuǎn)移酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

以天山雪蓮為例，使用SOPMA在線工具分析糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)以及各元件比例結(jié)果(表3)。

圖3天山雪蓮GT氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

植物種類α-螺旋/%無(wú)規(guī)則卷曲/%延伸鏈/%β-轉(zhuǎn)角/%白蘇子39.8237.5816.556.04黑莓40.0938.3416.784.74紅景天39.2939.2915.675.74花生40.8736.0916.657.39三七43.4337.9812.735.86石榴37.9340.4715.256.35天山雪蓮40.7838.8314.955.44野葛43.3734.3216.425.89桉樹40.4737.2615.856.42北柴胡41.4434.6716.077.82刺五加40.9542.1111.515.43滇牡丹39.2539.2516.235.26蒺藜苜蓿42.5835.4815.056.88毛白楊39.2539.2516.235.26七彩紅竹41.7738.6113.715.91薔薇37.6941.5416.024.75

由表3可知，在天山雪蓮的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋出現(xiàn)的概率最高為40.78%，無(wú)規(guī)則卷曲比例接近于α-螺旋為38.83%，延伸鏈較少為14.95%，β-轉(zhuǎn)角最少為5.44%。同時(shí)可以看出，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是糖基轉(zhuǎn)移酶多肽鏈中大量存在的結(jié)構(gòu)，高達(dá)79.61%。其余15種植物中的糖基轉(zhuǎn)移酶二級(jí)結(jié)構(gòu)具有類似的比例結(jié)構(gòu)。

3 討論

糖基轉(zhuǎn)移酶催化的糖基化反應(yīng)是三萜皂苷生物合成的最后一步,使得單糖與三萜皂苷苷元由糖苷鍵相連[10]。對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和代謝工程應(yīng)用方面起著重要作用，催化植物次生代謝物合成[11]。本文通過(guò)使用生物信息學(xué)方法，對(duì)16種植物的糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在氨基酸理化性質(zhì)的分析中顯示植物糖基轉(zhuǎn)移酶含量最豐富的氨基酸為L(zhǎng)eu、Gly、Val、Ser和Ala等，桉樹、北柴胡、滇牡丹、蒺藜苜蓿、毛白楊、七彩紅竹、薔薇和紅景天糖基轉(zhuǎn)移酶屬于穩(wěn)定類蛋白，其余則屬于不穩(wěn)定類蛋白；蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析中顯示紅景天糖基轉(zhuǎn)移酶可能含有信號(hào)肽，其余植物均不含有信號(hào)肽；糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角組成，且比例相似，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)，占總的80%左右，延伸鏈次之，為15%左右，β-轉(zhuǎn)角最少，為5%左右。

綜合三種不同分析工具對(duì)16種植物中糖基轉(zhuǎn)移酶的研究表明，這16種植物的糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白特性差別不大，顯示糖基轉(zhuǎn)移酶具有較高的保守性和穩(wěn)定性。同時(shí)許多基因組數(shù)據(jù)表明，糖基轉(zhuǎn)移酶基因在進(jìn)化上不是獨(dú)立的，而是與其他基因有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性；同時(shí)代謝途徑中存在基因共調(diào)節(jié)和蛋白相互作用[12]。糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)化主要依賴基因重復(fù)，特別是串聯(lián)重復(fù)，而不是片段重復(fù)[13]。對(duì)蛋白特性的解析能夠更清楚的揭示酶的保守結(jié)構(gòu)域及作用機(jī)制，為進(jìn)行糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程改造和分子進(jìn)化研究提供借鑒,本文章對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的生物信息學(xué)分析，也可為研究糖基轉(zhuǎn)移酶酶學(xué)特征及三萜皂苷代謝提供幫助。