李峻志，戴 璐，祁 鵬，張黎光，李安利，劉 愚，王殿振，喬 婷，陳世明

(1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.陜西寧陜縣秦南菌業(yè)科技有限公司，陜西 安康 711699)

秦嶺是橫亙于中國中部、東西走向的巨大山脈，是中國地理上重要的南北分界線，因其對海洋氣流和寒潮的屏障作用，所以也是我國南北氣候上的分界線。秦嶺獨特的地理環(huán)境和氣候條件決定了它擁有得天獨厚、豐富的大型真菌菌種資源[1]，但長期以來，沒有持續(xù)、系統(tǒng)的針對秦嶺地區(qū)羊肚菌種質(zhì)資源的調(diào)查。為了探明秦嶺地區(qū)羊肚菌種質(zhì)資源現(xiàn)狀和為后續(xù)的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，研究團隊在秦嶺地區(qū)選擇設(shè)計考察路線和調(diào)查樣地，對野生羊肚菌進行了種質(zhì)資源調(diào)查。本文對秦嶺地區(qū)羊肚菌的考察結(jié)果進行了初報。

1 工作方法

1.1 種質(zhì)資源調(diào)查

秦嶺地域廣闊、環(huán)境多樣，本團隊按照2008年開始的“秦嶺微生物種質(zhì)資源調(diào)查”項目[2]篩選出的秦嶺羊肚菌種質(zhì)資源相對豐富區(qū)域進行野外資源采集。在西安、寶雞、安康、商洛、漢中等地按照饒俊的方法[3]建立了10個樣地，具體調(diào)查區(qū)域和標(biāo)本收集數(shù)據(jù)見表1。在樣地中自海拔500 m～2 700 m向上進行調(diào)查工作，包括子實體典型標(biāo)本的采集、拍照、編號和形態(tài)特征的基本描述，記錄樣地的地理位置信息、標(biāo)本分布狀況、土壤類型和生境等。

1.2 菌株分離鑒定

1.2.1 分離菌絲體 先對采集的羊肚菌進行初步的形態(tài)鑒定，然后進行菌絲體的分離純化，具體方法參考陜西省微生物研究所真菌研究中心以往的工作[4-8]。

1.2.2 基因組DNA的提取和ITS區(qū)序列的分析 收集玻璃紙上的菌絲，用液氮研磨后，使用新型植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取樣品基因組DNA，保存于4 ℃。使用2720 Thermal cycler PCR儀(ABI Applied Biosystems)和2×PCRmix(潤德生物技術(shù)有限公司)PCR擴增ITS區(qū)，引物為ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)。50 μL反應(yīng)體系：引物各2 μL、模板2 μL、2×PCRmix 25 μL、ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性2 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。以PCR產(chǎn)物直接測序，由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。將序列在GenBank上進行BLAST分析。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制 結(jié)合陜西省微生物研究所真菌研究中心秦嶺羊肚菌鑒定結(jié)果[4-8]，選取部分菌株的ITS區(qū)序列，使用MEGA6構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 秦嶺地區(qū)野生羊肚菌種質(zhì)資源調(diào)查結(jié)果

本部分工作記錄了10個采集地的地理位置、標(biāo)本采集數(shù)量和生境條件，結(jié)果見表1。部分子實體照片見圖1。部分菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌絲體生長形態(tài)見圖2。

表1 秦嶺地區(qū)羊肚菌種質(zhì)資源調(diào)查結(jié)果

圖1 采集的部分子實體

2.2 分離與鑒定結(jié)果

綜合形態(tài)鑒定和分子鑒定結(jié)果可知，分離得到的115株羊肚菌純培養(yǎng)菌株可分為5個種，分別為粗腿羊肚菌、高羊肚菌、尖頂羊肚菌、梯棱羊肚菌和七妹羊肚菌。具體結(jié)果見表2。

圖2 部分菌株菌絲體在PDA平板上的形態(tài)

鑒定種屬株數(shù)分布區(qū)域粗腿羊肚菌(M. crassipes)8610個樣地均分布高羊肚菌(M. elata)12田峪河、冷水溝、紅河谷、流嶺尖頂羊肚菌(M. conica)15甘溪溝、平河梁、紅河谷梯棱羊肚菌(M. importuna)1漢中云霧山森林公園七妹羊肚菌(M. septimelata)1漢中云霧山森林公園

限于篇幅， 5個種各選取1個菌株列舉形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果如下：

QM-02為粗腿羊肚菌，菌蓋黃褐色，近圓錐形，長5.5 cm，寬3.5 cm，凹坑不規(guī)則形或近圓形；柄黃白色，中空，長6 cm，最粗處5 cm，基部膨大、有凹陷腔室。子囊圓柱形，無色透明， 200～260×17～21 μm；子囊孢子8個，橢圓形，15～25×9.5～16 μm；側(cè)絲頂端膨大。

M14為高羊肚菌，菌蓋黑褐色，圓錐形，長6 cm，寬4.5 cm，脊黑色，有短絨毛，縱脊發(fā)達；菌柄白色中空，圓柱形，長4.5 cm，粗2cm；子囊圓柱形，無色透明；子囊孢子8個，橢圓形，光滑，25～28×11～15 μm；側(cè)絲棒狀，有隔，頂端稍膨大。

SXM-03為尖頂羊肚菌，菌蓋深褐色，圓錐形、頂端稍尖，長5.3 cm，寬3.8cm，凹坑不規(guī)則，縱脊發(fā)達，黑色；菌柄白色中空，長5.5 cm，粗2 cm，圓柱形，表面有疣狀凸起，基部有不規(guī)則縱溝；子囊圓柱形，無色透明，250～300×15～25 μm；子囊孢子8個，橢圓形， 20～24×11～15 μm；側(cè)絲頂端膨大。

SXM-13為梯棱羊肚菌，菌蓋黑褐色，不規(guī)則近圓錐形，長8.5 cm，寬5.6 cm；菌蓋與菌柄連接的凹陷深3 mm；脊光滑銳利，凹坑光滑、排列成梯格狀；菌柄白色中空，長4.5 cm，最粗處2.8 cm，基部棒狀有縱向棱；子囊圓柱形、無色透明，180～300×10～25 μm；子囊孢子8個，橢圓形，光滑，20～25×10～15 μm；側(cè)絲圓柱形，有隔，150～270×7～15 μm，頂端近棒狀，在KOH溶液 (2%)中無色；不育脊上的剛毛100～200×10～28 mm，有隔，在KOH溶液 (2%)中棕色，末端細胞圓柱狀。

SXM-15為七妹羊肚菌，菌蓋黑褐色，不規(guī)則近圓錐形，長6.7 cm，寬4.4 cm；菌蓋與菌柄連接的凹陷深4 mm；脊光滑銳利，凹坑光滑、豎直延展；菌柄白色中空，長4.2 cm，最粗處2.2 cm，基部棒狀有凹陷腔室；子囊圓柱形、無色透明，160～275×15～25 μm；子囊孢子8個，橢圓形，光滑，15～25×10～20 μm；側(cè)絲圓柱形，有隔，100～200×5～12 μm，頂端近紡錘狀，在KOH溶液 (2%)中無色；不育脊上的剛毛50～220×7～20 mm，有隔，在KOH溶液 (2%)中棕色，末端細胞棒狀。

Bootstrap驗證，重復(fù)1000次

從圖3可以看出，屬于黑色羊肚菌類群[10]的高羊肚菌(M14、M15)、梯棱羊肚菌(SXM-13)、七妹羊肚菌(SXM-15)和尖頂羊肚菌(M17、SXM-03、SXM-04)與屬于黃色羊肚菌類群的粗腿羊肚菌(QM-01、QM-02)遺傳距離較遠。

3 小結(jié)

因調(diào)查時間、地點、范圍和人力的限制，本研究的種質(zhì)資源調(diào)查顯然未能涵蓋、描述全部秦嶺羊肚菌的種類分布，但從分子生物學(xué)角度明確了秦嶺野生羊肚菌的5個分布種。將來還需不斷地進行調(diào)查，進而補充完善秦嶺羊肚菌種質(zhì)資源數(shù)據(jù)。因為這些菌株均來源于秦嶺山區(qū)原始生長狀態(tài)環(huán)境，在長期的自然選擇中，其生長結(jié)實對秦嶺環(huán)境氣候特點可能存在一定的適應(yīng)性，基于這種考慮，我們希望將來從中選育出能夠在秦嶺山區(qū)典型環(huán)境下實現(xiàn)人工栽培的優(yōu)良菌種。