王書云，梁宏剛，黃健，王金輝*，楊寶峰

1.河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥化教研室/省部共建生物醫(yī)藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081；3.沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016

五味子為木蘭科植物五味子SchisandrachinensisBaill.的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古等地，故又稱北五味子。《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，性溫，味酸、甘，歸肺、腎、心經(jīng)，具有生津斂汗、益氣滋腎、寧心安神的作用，常用于久嗽虛喘、遺尿尿頻、心悸失眠等癥[1]。

五味子含有多種成分，主要成分為木脂素類，約占8%[2]。五味子中木脂素類化合物以聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素類化合物為主，且為五味子中最主要的活性成分，如：五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛J、戈米辛K、當(dāng)歸酰戈米辛H等[2-9]。

五味子為臨床常用中藥之一，具有保肝、鎮(zhèn)靜、催眠、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞、提高記憶力、抗老年癡呆、提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤等作用[10-18]，其質(zhì)量?jī)?yōu)劣直接影響到臨床療效和用藥安全。影響藥材質(zhì)量的因素很多，從產(chǎn)地、采收與加工，到五味子的炮制、運(yùn)輸與貯存等方面，均對(duì)五味子藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣產(chǎn)生影響。在前期對(duì)五味子指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上，確定五味子中7個(gè)主要的化合物，并對(duì)這7個(gè)主要化合物進(jìn)行提取、分離、鑒定，確定化合物為：五味子醇甲(1)、戈米辛D(2)、五味子醇乙(3)、當(dāng)歸酰戈米辛H(4)、五味子甲素(5)、戈米辛N(6)、五味子乙素(7)，化合物結(jié)構(gòu)見圖1。本文建立同時(shí)測(cè)定五味子中7個(gè)主要的聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素類化合物含量的HPLC方法，為五味子的質(zhì)量控制及保證五味子臨床用藥的安全、有效、質(zhì)量可控提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(HPLC Waters 2690 Separations Module)，檢測(cè)器：Waters 2996 photodiode Array Detector，色譜柱：SunFireTMC18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；KQ 5200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FA1004N電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；粉碎機(jī)(型號(hào)：FW-80，功率：460 W，轉(zhuǎn)速：24 000轉(zhuǎn)/min)；SPE固相萃取小柱(ODS，0.5 g)等。

1.2 試藥

液相分析用甲醇、乙腈為色譜純(J.T.Baker)；甲醇、乙醇、95%乙醇等分析純有機(jī)試劑(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；磷酸為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為雙蒸水。

對(duì)照品五味子醇乙(成都生物制品檢定所，批號(hào)：MUST-13042601)；五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110857-201211、110765-200710、0764-200107)；戈米辛D、戈米辛N、當(dāng)歸酰戈米辛H為實(shí)驗(yàn)室自制，純度均大于98%。

五味子藥材分別購于沈陽、丹東、吉林、黑龍江等地藥材市場(chǎng)或藥店。

2 方法

2.1 色譜條件

SunFireTMC18色譜柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A(乙腈)-B(水)，梯度洗脫：0～10 min，38%～44%A；10～18 min，44%～45%A；18～28 min，45%～48%A；28～35 min：48%～60%A；35～37 min，60%～47%A；37～65 min，47%～48%A；65～67 min，48%～60%A；67～76 min，60%～61%A；76～78 min，61%～85%A，檢測(cè)波長：254 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，理論塔板數(shù)以五味子醇甲計(jì)算，不低于5000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、當(dāng)歸酰戈米辛H適量，色譜甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為1.00、1.20、0.94、1.18、1.46、1.13、2.10 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

分別精密吸取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、當(dāng)歸酰戈米辛H適量至5 mL容量瓶，色譜甲醇定容至刻度，搖勻，即得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、當(dāng)歸酰戈米辛H質(zhì)量濃度分別為45.00、9.96、7.98、14.99、9.05、10.96、10.92 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

圖1 化合物的結(jié)構(gòu)式

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取五味子藥材粉末約1.0 g，精密加入甲醇25 mL，稱質(zhì)量，超聲30 min，冷卻，稱質(zhì)量，補(bǔ)質(zhì)量，精密取上清液2 mL過SPE柱，色譜甲醇洗3次，每次2 mL，將濾液轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶，色譜甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，即得藥材供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性

分別精密吸取空白溶劑、混合對(duì)照品溶液、藥材供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，繪制高效液相色譜圖，見圖2。由色譜圖可知，在對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，且其他雜質(zhì)對(duì)五味子多組分含量測(cè)定均無干擾，說明此方法專屬性良好。

注：A.對(duì)照品；B.樣品；1.五味子醇甲；2.戈米辛D；3.五味子醇乙；4.當(dāng)歸酰戈米辛H；5.五味子甲素；6.戈米辛N；7.五味子乙素。圖2 對(duì)照品和供試品的HPLC圖

3.2 線性關(guān)系考察

取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、當(dāng)歸酰戈米辛H質(zhì)量濃度分別為45.00、9.96、7.98、14.99、9.05、10.96、10.92 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液過0.22 μm濾膜，分別精密進(jìn)樣2、5、10、20、30、40、50 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得各化合物的回歸方程，見表1。

3.3 精密度試驗(yàn)

取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、當(dāng)歸酰戈米辛H質(zhì)量濃度分別為45.00、9.96、7.98、14.9、9.05、10.96、10.92 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液在2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，進(jìn)樣量20 μL，7個(gè)成分的RSD分別為0.93%、0.88%、0.31%、0.91%、1.86%、0.72%、1.41%(n=6)，說明儀器精密度良好，符合含量測(cè)定的要求。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密取五味子藥材粉末6份，每份約1.0 g，按2.3項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，在2.1項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定，7個(gè)成分的RSD分別為1.65%、1.54%、1.55%、1.80%、1.26%、1.94%、1.57%(n=6)，符合含量測(cè)定的要求。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按2.3項(xiàng)下方法制備的供試品溶液，在0、4、8、12、24、48 h，分別進(jìn)樣20 μL，在2.1項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定，結(jié)果表明7個(gè)化合物在48 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD分別為0.52%、1.58%、0.63%、1.51%、1.71%、1.41%、1.85%(n=6)符合含量測(cè)定的要求。

表1 五味子中7個(gè)主要木脂素含量測(cè)定的線性、檢測(cè)限及定量限

3.6 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的五味子藥材粉末6份，每份約0.5 g，分別加入一定量的對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，在2.1項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 五味子中7個(gè)木脂素含量測(cè)定的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.7 樣品測(cè)定

分別精密稱取不同產(chǎn)地五味子藥材粉末約1.0 g，按2.3項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，在2.1項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定不同產(chǎn)地五味子中7個(gè)化合物的含量，結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地五味子中7個(gè)木脂素的含量測(cè)定結(jié)果 mg·g-1

4 討論

4.1 色譜柱的選擇

本文考察了SunFireTM(150 mm×4.6 mm，5 μm)，Shimadzu vp-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)，Kromasil(150 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱對(duì)五味子甲醇提取物的分離情況，綜合峰形、分離度、使用范圍等因素，選定SunFireTM色譜柱作為分析柱。

4.2 色譜條件的選擇

為了提高分析的靈敏度和精確度，本文考察了不同流動(dòng)相組成(甲醇-水，乙腈-水溶液)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果表明，流動(dòng)相采用水(A)-乙腈(B)梯度洗脫，能夠獲得良好的色譜分離效果。采用二極管陣列檢測(cè)器(190～800 nm)對(duì)檢測(cè)波長進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素類化合物在254 nm處均有較好的紫外吸收，且色譜峰信息最為豐富，雜質(zhì)較少，因此，選擇254 nm作為檢測(cè)波長。

4.3 供試品溶液制備的優(yōu)化

為了使五味子中聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素類化合物能被更完全地提取出來，本文首先對(duì)提取方式(超聲提取、回流提取、索氏提取)、提取溶劑(甲醇、30%甲醇水、50%甲醇水、70%甲醇水、90%甲醇水)、料液比(10、20、25、50倍量)、提取時(shí)間(15、30、60、90 min)等影響因素進(jìn)行考察，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，以25倍量甲醇為提取溶劑、超聲提取30 min制備樣品的色譜圖峰面積相對(duì)較大，化合物總含量相對(duì)較高，故最終確定供試品的制備方法：25倍量甲醇超聲提取30 min。

本文建立了同時(shí)定量測(cè)定五味子中7個(gè)主要木脂素類化合物的HPLC方法，并測(cè)定了收集到的不同產(chǎn)地的15批五味子樣品中7個(gè)主要木脂素類化合物的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地五味子中化合物的含量差別不大，7個(gè)木脂素的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為16.27 mg·g-1，最低為9.52 mg·g-1。該方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可用于五味子的質(zhì)量評(píng)價(jià)。