王福秋 張 燕

(北京化工大學(xué) 文法學(xué)院，北京 100029)

疲勞從1880年Mosso首次被發(fā)現(xiàn)已有100多年的歷史，但圍繞運(yùn)動疲勞(Exercise-induced Fatigue)產(chǎn)生機(jī)制及診斷方法進(jìn)行的相關(guān)研究一直在繼續(xù)[1]。代謝組學(xué)是研究機(jī)體代謝產(chǎn)物譜變化的一種新的系統(tǒng)方法，它作為后基因時(shí)代的新興組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)共同構(gòu)成了系統(tǒng)生物學(xué)，通過對生物信息的化學(xué)分析和處理，使人們能夠從分子水平研究生命現(xiàn)象、探討生命本質(zhì)、逐步系統(tǒng)地認(rèn)識生命發(fā)展規(guī)律[6]。代謝組學(xué)通過血漿或尿液代謝產(chǎn)物的整體模式或指紋分析，比單一靶標(biāo)具有更好的一致性和預(yù)見性[7]，可能對建立運(yùn)動疲勞的客觀診斷方法提出新的思路。北京師范大學(xué)運(yùn)動人體科學(xué)實(shí)驗(yàn)室從2001年開始采用神經(jīng)生物學(xué)、電生理學(xué)、生命分析化學(xué)和運(yùn)動生理學(xué)等方法對運(yùn)動疲勞的中樞機(jī)制展開了一系列研究，從神經(jīng)元電活動、遞質(zhì)和受體表達(dá)、能量代謝等方面，多角度闡明了黑質(zhì)—紋狀體神經(jīng)通路對運(yùn)動疲勞產(chǎn)生的中樞調(diào)控作用及其機(jī)制[2-5]，對開發(fā)研制延緩疲勞產(chǎn)生和加速疲勞消除的分子靶向藥物，尋找運(yùn)動疲勞的有效診斷方法具有重要意義。本課題在前期研究成果基礎(chǔ)上采用基于代謝組學(xué)的核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)和模式識別(pattern recognition analysis, PRA)技術(shù)，對人體在一次性力竭運(yùn)動前后尿液的代謝圖譜進(jìn)行分析，初步揭示代謝產(chǎn)物變化與運(yùn)動疲勞的關(guān)系，以期為代謝組學(xué)在運(yùn)動人體科學(xué)研究中的應(yīng)用開辟一條新途徑。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象與分組

選取北京師范大學(xué)體育與運(yùn)動學(xué)院36名男生作為受試者，年齡在18-22歲之間，平均身高175.17±5.55cm，體重68.66±5.18kg，身體健康，運(yùn)動水平均達(dá)2級以上。實(shí)驗(yàn)前一個(gè)月內(nèi)未服用任何藥物，實(shí)驗(yàn)前一天和實(shí)驗(yàn)當(dāng)天統(tǒng)一控制受試者飲食。

1.2 主要儀器與試劑

德國Cortex Metalyzer 3B運(yùn)動心肺功能系統(tǒng)、荷蘭Lode Valiant跑臺、日本Arkray自動尿液分析儀、德國Eppendorf Centrifuge 5417R冷凍離心機(jī)、德國Crist冷凍干燥機(jī)、美國Revco超低溫冷凍風(fēng)冷式冷凝器、瑞士Bruker Avance DRX 500型超導(dǎo)核磁譜儀、重水(deuterium oxide/D2O, 美國 Noreu 公司)、2,2,3,3,三甲基甲硅烷基丙酸(3-trimethylsilyl-[2,2,3,3-D4]-propionate/TSP, 美國 CIL公司)、磷酸緩沖溶液(PBS, 北京化工廠)等。

1.3 運(yùn)動負(fù)荷方案

依據(jù)田野[8]等人的運(yùn)動方案，根據(jù)運(yùn)動時(shí)耗氧量占最大攝氧量的百分比控制運(yùn)動強(qiáng)度，采用一次性多級遞增負(fù)荷跑臺運(yùn)動方式建立人體運(yùn)動疲勞模型。測試要求：受試者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室靜坐30min，測定安靜時(shí)心率；在跑臺上以5000m/h的速度慢跑3min作為準(zhǔn)備活動；遞增跑臺運(yùn)動開始的起始速度為8000m/h，坡度為0 %；每2min增加2.5%的坡度遞增運(yùn)動強(qiáng)度，速度不變；受試者連續(xù)運(yùn)動至力竭，經(jīng)過反復(fù)鼓勵(lì)仍不能堅(jiān)持為止；恢復(fù)階段在無負(fù)荷狀態(tài)下繼續(xù)運(yùn)動2min。測試期間用Polar心率表監(jiān)測受試者運(yùn)動過程中的心率。測試前24h內(nèi)要求受試者不參加劇烈的體力活動，禁止吸煙，測試在餐后2～3h后進(jìn)行。

1.4 尿液樣品的收集與處理

收集受試者運(yùn)動前清晨、運(yùn)動疲勞后第一次的中段尿液，分別裝入采樣盒內(nèi)，取1ml尿液進(jìn)行超低溫冷凍干燥處理，-20℃保存待用。核磁共振信號采集前，樣品4°C，13000×g離心10min，取上清液以2: 1加入磷酸鹽D2O緩沖溶液(0.2mol?L-1 Na2HPO4/0.2 mol?L-1NaH2PO4，pH 7.4)，靜置10min，再于4°C，13000×g離心10min，取上清液0.55mL加入適量的D2O和TSP置于5mm核磁管中進(jìn)行NMR測試。另取少量運(yùn)動前、后尿液用于尿十項(xiàng)生化指標(biāo)檢測。

1.5 NMR數(shù)據(jù)采集和處理

在AVANCE DRX 500型NMR儀上調(diào)用noesypr1d脈沖序列，采用預(yù)飽和方式壓制水峰，脈沖功率50dB，脈沖寬度12.4?s，射頻脈沖-1dB，混合時(shí)間0.8s，增益640，延遲時(shí)間為2s。采樣次數(shù)128次，控制溫度300±0.1K。自由感應(yīng)衰減(free induction decay，F(xiàn)ID)信號經(jīng)過傅立葉變換轉(zhuǎn)為1H-NMR譜圖。尿液樣品1H-NMR譜圖以TSP為化學(xué)位移參考峰的位置，將調(diào)整相位和基線后的氫譜δ0.2～9.8區(qū)域進(jìn)行分段積分，每段0.04ppm(500M譜儀上對應(yīng)于20Hz)，將譜圖劃分成若干區(qū)域。為了避開溶劑峰壓制對譜圖造成的影響，水峰附近的區(qū)域(δ4.4～5.0)被去除。將積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化后以Excel文件儲存，用于隨后的主成分分析(principal components analysis, PCA)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

將積分值進(jìn)行中心化和比例換算，求出主成分(principal components , PC)，利用PC對運(yùn)動前后尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析。根據(jù)一定規(guī)律和比照檢測不同狀態(tài)下代謝表達(dá)譜的變化，從復(fù)雜的1H- NMR波譜數(shù)據(jù)中尋找導(dǎo)致運(yùn)動員疲勞代謝改變的作用位點(diǎn)及相關(guān)生物標(biāo)志物。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均以mean±SD表示。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)所得數(shù)據(jù)，選擇LSD比較各組間差異，P<0.05表示顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 人體運(yùn)動疲勞狀態(tài)的評價(jià)

36名受試者平均運(yùn)動至力竭時(shí)間20.72±1.87min，運(yùn)動前平均心率為67.41±7.80次/min， 運(yùn)動后平均心率為195.53±7.72次/min，最高心率為220±7.72次/min，說明受試者均達(dá)到極限負(fù)荷心率。對受試者運(yùn)動疲勞后的尿樣進(jìn)行尿十項(xiàng)檢測，結(jié)果見表1。從表1結(jié)果顯示，受試者運(yùn)動疲勞后的尿樣中出現(xiàn)尿蛋白的陽性率為80.6%，尿潛血的陽性率為25%，還有少數(shù)運(yùn)動員出現(xiàn)尿糖、尿酮體和尿比重增加等記錄，說明受試者處于運(yùn)動疲勞狀態(tài)。

表1 受試者運(yùn)動疲勞后尿樣檢測結(jié)果一覽表

2.2 運(yùn)動疲勞前后尿樣1H-NMR掃描典型圖譜

受試者運(yùn)動疲勞前后1H-NMR典型圖譜如圖1、2所示。通過對同一受試者運(yùn)動疲勞前后1H-NMR圖譜的對比分析，發(fā)現(xiàn)與運(yùn)動疲勞后尿樣1H-NMR圖譜峰出現(xiàn)了明顯的變化。主要特征為：譜峰在1.4ppm、2.7ppm、3.5ppm、4.0ppm、5.5ppm和8.5ppm處均較運(yùn)動前安靜狀態(tài)有明顯升高，分別用序號1～6表示。

A: 安靜狀態(tài)；B: 疲勞狀態(tài)圖1 典型受試者在運(yùn)動疲勞前后1H-NMR圖譜比較

圖2 典型受試者在運(yùn)動疲勞后1H-NMR圖譜變化特征

2.3 主成分分析結(jié)果

對受試者運(yùn)動疲勞前后尿樣進(jìn)行PCA分析，結(jié)果用得分散點(diǎn)圖(score plot)和因子載荷圖(loading plot)表示(圖3、4)。由圖3、4可見，運(yùn)動前與疲勞后的主成分積分值分別分布在橢圓型散點(diǎn)圖(95%置信區(qū)間內(nèi))的左右側(cè)兩個(gè)區(qū)域內(nèi)，無交叉與重疊。而且在1.3403ppm、1.3804 ppm、3.1005 ppm、4.1399 ppm和4.18 ppm處的散點(diǎn)出現(xiàn)明顯偏移。

L: 安靜狀態(tài); R: 疲勞狀態(tài)圖3 受試者運(yùn)動疲勞前后尿樣 PCA 分析的散點(diǎn)分布圖

圖4 受試者運(yùn)動疲勞前后尿樣PCA分析的因子載荷圖

3 分析與討論

本實(shí)驗(yàn)采用一次性遞增負(fù)荷的跑臺運(yùn)動方式建立了人體運(yùn)動疲勞模型。通過生理生化指標(biāo)檢測表明，受試者平均運(yùn)動至力竭的時(shí)間為20.72±1.87min；運(yùn)動前平均心率為67.41±7.80次/min，運(yùn)動后平均心率為195.53±7.72次/min，最高心率為220±7.72次/min，均已達(dá)到極限負(fù)荷心率。受試者運(yùn)動疲勞后出現(xiàn)尿蛋白的陽性率為80.6%，尿潛血的陽性率為25%，還有少數(shù)運(yùn)動員出現(xiàn)尿糖、尿酮體和尿比重增加等現(xiàn)象，上述結(jié)果說明受試者運(yùn)動后均已達(dá)到運(yùn)動疲勞狀態(tài)[9]。

將實(shí)驗(yàn)前后采集的尿液進(jìn)行1H-NMR檢測和PCA進(jìn)行分析，進(jìn)而檢測由于運(yùn)動訓(xùn)練量和強(qiáng)度變化而引起代謝物的變化。進(jìn)行高通量的代謝組學(xué)分析后，運(yùn)動員尿液樣本的動態(tài)代謝的輪廓都被記錄下來。運(yùn)動疲勞后與安靜時(shí)的尿液在積分散點(diǎn)圖中呈聚類型分布，兩組間未見重疊，反映運(yùn)動員的身體機(jī)能狀態(tài)的變化。運(yùn)動前安靜時(shí)的尿樣集中分布在左側(cè)，而疲勞后的尿樣集中分布在右側(cè)，完全將受試者運(yùn)動前與疲勞后的尿樣進(jìn)行明顯區(qū)分，說明尿液的代謝組學(xué)分析可以較好的反應(yīng)運(yùn)動前后機(jī)體代謝特征的變化。尿液中的主要代謝物，包括TMAO、?；撬岷婉R尿酸的濃度在運(yùn)動疲勞后是較高的。通過分析由于疲勞前后運(yùn)動強(qiáng)度與量不同而引起的代謝物的差異，并且在代謝通路上找出代謝物彼此之間的聯(lián)系。在運(yùn)動科學(xué)研究中三羧酸循環(huán)被認(rèn)為是關(guān)于能量代謝的重要通路。隨著訓(xùn)練強(qiáng)度的變化而引起了相關(guān)代謝物發(fā)生變化，這表明不同訓(xùn)練強(qiáng)度和訓(xùn)練量影響著TCA循環(huán)。通過loading圖顯示，在1.3403ppm、1.3804 ppm、3.1005 ppm、4.1399 ppm和4.18 ppm處的物質(zhì)對圖譜的影響最大。進(jìn)一步分析確定這些物質(zhì)的種類將有助于尋找運(yùn)動疲勞的標(biāo)志物并判斷疲勞產(chǎn)生的潛在原因。

運(yùn)動性疲勞是指人體長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動后出現(xiàn)的一種組織器官甚至整個(gè)機(jī)體的工作能力暫時(shí)性降低的現(xiàn)象。疲勞的產(chǎn)生與運(yùn)動導(dǎo)致體內(nèi)代謝產(chǎn)物積累、能量物質(zhì)耗竭、基質(zhì)生化狀態(tài)改變等代謝調(diào)節(jié)功能失調(diào)有關(guān)[10]。近年來，隨著競技運(yùn)動水平的不斷提高和比賽的日趨激烈，運(yùn)動員在訓(xùn)練和比賽中承受的運(yùn)動負(fù)荷越來越大，對機(jī)體極限的挑戰(zhàn)越來越高。因此，有關(guān)運(yùn)動疲勞的產(chǎn)生機(jī)制和疲勞的早期診斷方法等一系列問題早已成為國內(nèi)外運(yùn)動醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。然而，以往的一些研究均依據(jù)運(yùn)動員血樣或尿樣中不同物質(zhì)含量的變化作為判斷運(yùn)動疲勞程度的生化指標(biāo)，由于指標(biāo)選擇有限且個(gè)體差異因素難以剔除等不足大大降低了疲勞判斷的準(zhǔn)確性。代謝組學(xué)主要研究生物體系受刺激或擾動后其代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，并通過生物體液的代謝物分析來反映機(jī)體系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài)[11]。1H-NMR作為當(dāng)前代謝組學(xué)研究中的主要技術(shù)之一，可實(shí)現(xiàn)對樣品非破壞性、非選擇性的分析, 盡可能地保留和反映總的代謝產(chǎn)物的信息，具有簡單、無創(chuàng)、靈敏性高的特點(diǎn)，已開始應(yīng)用于臨床藥物篩選和疾病診斷[12-15]。本研究直接選取運(yùn)動員作為實(shí)驗(yàn)對象，對運(yùn)動員運(yùn)動疲勞后尿液的變化進(jìn)行了代謝組的初步探索性研究，研究結(jié)果將為運(yùn)動疲勞的早期診斷提供新思路，開辟新途徑。

4 小結(jié)

本研究通過對人體運(yùn)動疲勞前后尿液的1H-NMR檢測與分析發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動疲勞前后的尿液在積分散點(diǎn)圖中呈聚類型分布，兩組間未見重疊，且運(yùn)動疲勞后尿樣1H-NMR圖譜峰較運(yùn)動前出現(xiàn)了明顯的變化。本研究結(jié)果初步證明，人體尿液的代謝組學(xué)分析可更客觀地反應(yīng)運(yùn)動疲勞前后體內(nèi)代謝的變化特征，有助于尋找運(yùn)動疲勞的代謝標(biāo)志物，也可作為簡單、無創(chuàng)、靈敏性高的運(yùn)動疲勞早期診斷方法。但人體代謝通路的復(fù)雜性及各個(gè)通路之間的相互擾動，及分析方法的可靠性等還存在很多問題，在運(yùn)用代謝組學(xué)研究運(yùn)動疲勞的相關(guān)機(jī)制還有很遠(yuǎn)的路要走。