程宇， 周丁華， 閆濤， 王進(jìn)， 呂偉

(1.錦州醫(yī)科大學(xué) 火箭軍總醫(yī)院 研究生培養(yǎng)基地， 遼寧省 錦州市 121001； 2.中國(guó)人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心 肝膽外科， 北京市 100088)

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是一種以胰島β細(xì)胞永久性破壞導(dǎo)致胰島素生成不足、糖代謝紊亂的自身免疫性疾病[1].近年糖尿病發(fā)病率不斷攀升，外源性胰島素大量應(yīng)用成為臨床治療中的常規(guī)選擇，但治療過(guò)程中出現(xiàn)的嚴(yán)重低血糖以及視網(wǎng)膜、神經(jīng)系統(tǒng)病變等影響了患者的生活質(zhì)量[2].現(xiàn)階段，胰島移植是針對(duì)T1DM最具前景的治療方式[3].作為一種β細(xì)胞替代療法，治療的關(guān)鍵是選擇適宜胰島定植的部位[4].目前可供選擇的定植部位主要有門靜脈[5-6]、脾臟[7]以及腎被膜[8]等，但因存在諸多并發(fā)癥而限制在臨床中的推廣.有研究結(jié)果顯示，網(wǎng)膜組織可為胰島定植提供穩(wěn)定的定植位點(diǎn)[9].因此本研究對(duì)腸系膜部與腎被膜下進(jìn)行胰島移植的效果對(duì)比分析，探討經(jīng)腸系膜部移植胰島的療效，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量300～450 g，購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXX-軍.實(shí)驗(yàn)室光照12 h晝夜交替，動(dòng)物飼養(yǎng)溫度控制在25 ℃～28 ℃，相對(duì)濕度為45%～60%，自由進(jìn)水及攝食.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、V型膠原酶、臺(tái)盼藍(lán)、Hanks液、RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；雙硫腙(diphenylthiocarbarzone，DTZ)購(gòu)自北京國(guó)藥集團(tuán)有限公司；Ficoll400液購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司；水合氯醛購(gòu)自濟(jì)南嘉格生物科技公司.

超凈臺(tái)為日本Hitachi公司產(chǎn)品；低溫離心機(jī)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；血糖儀及試紙購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司；顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品；80目不銹鋼過(guò)濾網(wǎng)及手術(shù)相關(guān)器械購(gòu)自上海手術(shù)器械廠.

1.3 方法

1.3.1 大鼠糖尿病模型建立及分組

大鼠禁食24 h，不禁水.STZ溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55 mg/kg)腹腔注射誘導(dǎo)建立1型糖尿病模型.非禁食狀態(tài)下尾靜脈取血，隨機(jī)血糖濃度>16.70 mmol/L，維持2 d以上且出現(xiàn)多飲、多食、多尿及體質(zhì)量下降癥狀時(shí)視為建模成功[10].隨機(jī)將模型鼠分為腸系膜部胰島移植組(腸系膜組)和腎被膜下胰島移植組(腎被膜組)，每組18只.

1.3.2 胰島分離與純化

體積分?jǐn)?shù)為5%水合氯醛按每kg體質(zhì)量7 mL腹腔注射麻醉供體大鼠，暴露膽總管并結(jié)扎下端與十二指腸交匯處，沿上端推注V型膠原酶(質(zhì)量濃度1.00 mg/mL)4.00～5.00 mL，見(jiàn)胰腺充盈良好后完整切除并剪碎，38℃水浴消化20 min，Hanks液終止消化.80目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾后4 ℃下1 000 r/min離心5min，棄上清；洗滌3次后加入體積分?jǐn)?shù)為25%Ficoll 400 4 mL吹打混勻，次序添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23%、20%、11%的Ficoll液各2 mL，2 000 r/min離心15 min；靜置后將20%～23%和23%～25%界面的胰島吸出，洗滌后移入RPMI1640培養(yǎng)基，胰島分離完成[11].倒置顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每只供體可獲取的胰島數(shù)量，選取直徑>150 μm的細(xì)胞為1個(gè)胰島當(dāng)量(islet equivalent，IEQ)[12]；DTZ對(duì)胰島細(xì)胞染色計(jì)算胰島純度(%);臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算胰島存活率(%).

胰島純度=DTZ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%

胰島存活率=未染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%.

1.3.3 移植胰島

腸系膜組大鼠麻醉后，腹部正中切口暴露腸系膜根部，1.00 mL注射器細(xì)針穿刺注入胰島，每只大鼠種植800IEQ(圖1A).種植完畢，輕柔按壓穿刺部位，確認(rèn)無(wú)出血、滲液后逐層關(guān)閉腹腔.術(shù)后連續(xù)2d肌注青霉素鈉(質(zhì)量濃度0.12 g/mL)1 mL抗感染治療.腎被膜組取左肋緣下切口進(jìn)入腹腔，暴露左側(cè)腎臟，將同等量胰島緩慢推注至腎被膜下，其余操作同腸系膜組(圖1B).

A：腸系膜根部胰島移植部位，此處可見(jiàn)粗大的腸系膜動(dòng)脈血管弓；B：腎被膜下胰島移植部位.

A：The site of islet transplantation in mesenteric root, and a large mesenteric arterial arch can be seen here; B： The site of islet transplantation in renal capsule.

圖1 兩組大鼠胰島移植部位

Fig.1 Sites of islet transplantation in two groups of rats

1.3.4 血糖水平檢測(cè)

移植前1 d尾靜脈取血監(jiān)測(cè)兩組大鼠血糖水平；移植后1周內(nèi)每天監(jiān)測(cè)血糖變化，第2～9 周內(nèi)，每3 d監(jiān)測(cè)1次隨機(jī)血糖.連續(xù)2 d血糖濃度<11.10 mmol/L，證明血糖恢復(fù)正常，移植物存活；若隨機(jī)血糖濃度>16.70 mmol/L，可視為胰島功能喪失[13].記錄每組大鼠移植物存活時(shí)間.

1.3.5 高糖刺激實(shí)驗(yàn)

移植后10、31 d通過(guò)放射免疫法檢測(cè)兩組大鼠經(jīng)高糖刺激前后血清C肽水平.先將大鼠禁食12 h，尾靜脈取血檢測(cè)C肽水平；按每kg體質(zhì)量10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的葡萄糖溶液灌胃處理，10 min后復(fù)測(cè).比較刺激前后血清C肽含量變化情況.

1.3.6 腹腔糖耐量功能

移植后16 d行腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn).將兩組大鼠禁食12 h后，按每kg體質(zhì)量腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的葡萄糖溶液2 g，注射后于2、5、10、15、30、60、90、120 min測(cè)定血糖濃度，評(píng)價(jià)胰島功能[14].

1.3.7 組織病理學(xué)

移植術(shù)后40 d，兩組大鼠隨機(jī)各選擇1只，分別切取移植部位組織行HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況分析

腸系膜組1只大鼠于術(shù)后19 d死亡，腎被膜組2只分別于13、47 d死亡，最終腸系膜組17只、腎被膜組16只大鼠進(jìn)入結(jié)果分析.

2.2 胰島計(jì)數(shù)及純度、活性測(cè)定

DTZ染色后胰島呈猩紅色，非胰島細(xì)胞不著色(圖2A)；臺(tái)盼藍(lán)染色后，細(xì)胞膜破損或死亡的胰島被染成藍(lán)色，正常胰島不被染色(圖2B).每只供體可獲取(347.08±33.22)IEQ，胰島純度為(88.03±4.94)%，胰島存活率為(90.55±3.98)%.

A：DTZ染色后的胰島，鏡下可見(jiàn)圓形或橢圓形猩紅色胰島；B：臺(tái)盼藍(lán)染色后的胰島，形態(tài)和功能正常的胰島不著色.

A：The scarlet islets were seen round or oval by microscope after DTZ staining; B： The islets after Trypan Blue and the normal morphology and function islets were not stained.

圖2 顯微鏡下經(jīng)DTZ和臺(tái)盼藍(lán)染色的后胰島形態(tài)(×20)

Fig.2 Morphology of islets stained by DTZ and Trypan Blue under microscope

2.3 血糖濃度水平測(cè)定

移植前兩組大鼠血糖濃度相比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.203，P=0.841)，均處于高血糖狀態(tài)；移植后3 d，兩組大鼠血糖水平均恢復(fù)正常，與術(shù)前相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=16.245、16.642，P<0.001，表1).采用重復(fù)測(cè)量方差分析：移植后不同時(shí)間點(diǎn)，兩組血糖相比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=100.976，P<0.001)；移植后兩組間降糖療效比較，腸系膜組血糖濃度較腎被膜下組低，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=66.421，P<0.001).

進(jìn)一步選取術(shù)后10、25、40、43 d血糖濃度進(jìn)行比較，其中10、25、40 d時(shí)兩組大鼠血糖水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但43 d時(shí)兩組血糖濃度相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表1).結(jié)合移植后血糖水平波動(dòng)曲線提示：腸系膜組正常血糖水平維持時(shí)間較腎被膜組長(zhǎng)(圖3).

表1 兩組大鼠移植前后不同時(shí)間點(diǎn)血糖濃度
Table 1 Blood glucose concentration at different time points before and after transplantation in two groups of rats

組別移植前移植后3 d移植后10 d移植后16 d移植后25 d腸系膜組26.06±1.9912.99±2.432)8.29±0.957.27±0.596.96±0.91腎被膜組25.86±3.421)10.07±1.043)8.07±0.804)6.91±1.217.51±1.025)組別移植后34 d移植后40 d移植后43 d移植后52 d移植后61 d腸系膜組7.78±1.328.04±2.927.46±2.707.37±2.8113.08±2.34腎被膜組8.99±3.849.79±3.446)10.62±1.607)18.81±3.4020.65±3.44

1)與移植前腸系膜組比較，P=0.841； 2)與移植前比較，t=16.245，P=0.000； 3)與移植前比較，t=16.642，P=0.000； 4)術(shù)后10 d兩組血糖濃度比較，t=0.736，P=0.468； 5)術(shù)后25 d兩組比較，t=-1.624，P=0.115； 6)術(shù)后40 d兩組比較，t=-1.583，P=0.123； 7)術(shù)后43 d兩組比較，t=-3.930，P=0.000.

圖3 兩組大鼠胰島移植前后不同時(shí)間點(diǎn)血糖濃度變化趨勢(shì)

Fig.3 Trend of blood glucose concentration at different time points before and after islet transplantation in two groups of rats

2.4 血清C肽水平監(jiān)測(cè)

術(shù)后10 d，高糖刺激前兩組大鼠血清C肽相比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-0.762，P=0.452)，刺激后兩組水平相比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-1.635，P=0.112)；分別對(duì)比各組刺激前、后C肽水平，提示兩組刺激后含量均明顯升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001，表2).術(shù)后31d，刺激前兩組C肽含量相比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=4.307，P=0.000)，刺激后兩組水平相比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=5.419，P=0.000)；對(duì)比兩組刺激前、后結(jié)果，提示腸系膜組C肽含量明顯升高，腎被膜組水平輕度升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001，圖4).

表2 兩組大鼠高糖刺激前后血清C肽質(zhì)量濃度

Table 2 Serum C-peptide levels before and after hyperglycemic stimulation in two groups of rats

組別移植后10 d移植后31 d刺激前刺激后刺激前刺激后腸系膜組0.192±0.0440.766±0.0651)0.243±0.0400.726±0.1333)腎被膜組0.204±0.0470.805±0.0732)0.165±0.0600.491±0.1064)

1)移植后10 d，刺激后與刺激前C肽水平相比，t=-30.330，P=0.000； 2)刺激后與刺激前C肽水平比較，t=-27.836，P=0.000； 3)移植后31 d，與刺激前比較，t=-13.910，P=0.000； 4)與刺激前比較，t=-10.327，P=0.000.

A:移植術(shù)后10 d，高糖刺激前后兩組大鼠血清C肽水平變化； B:移植術(shù)后31 d，高糖刺激前后C肽變化.

A:Changes of serum C-peptide levels in rats of two groups before and after hyperglycemic stimulation 10 days after transplantation. B:Changes of C-peptide before and after hyperglycemic stimulation 31 days after transplantation.

圖4 移植術(shù)后兩組大鼠經(jīng)高糖刺激前后血清C肽質(zhì)量濃度變化趨勢(shì)

Fig.4 Trend of Serum C-peptide before and after hyperglycemic stimulation in two groups of rats

2.5 腹腔糖耐量功能

術(shù)后16 d，腹腔糖耐量數(shù)據(jù)表明，不同時(shí)間點(diǎn)血糖濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=176.301，P<0.001)，兩組大鼠血糖水平于15 min達(dá)到峰值，隨后平穩(wěn)下降.進(jìn)一步選取30、60 min結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)，血糖水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示兩移植組大鼠腹腔糖耐量功能良好(圖5).

2.6 胰島移植物存活時(shí)間

移植后，根據(jù)監(jiān)測(cè)血糖濃度水平記錄移植胰島的存活時(shí)間.腸系膜組胰島平均生存時(shí)間為(60.28±1.45)d，中位生存時(shí)間為61 d；腎被膜組平均生存時(shí)間為(45.99±2.38)d，中位生存時(shí)間為46 d；兩組間相比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001，圖6).

1)糖刺激30 min后，兩組大鼠血糖濃度比較，t=1.365，P=0.182；2)糖刺激60 min后，兩組大鼠血糖濃度比較，t=0.819，P=0.419.

1) Compare of the blood glucose between two groups of rats after 30 minutes of hyperglycemic stimulation,t=1.365,P=0.182. 2)Compare of the blood glucose between two groups after 60 minutes of hyperglycemic stimulation,t=0.819，P=0.419.

圖5 移植術(shù)后16 d兩組大鼠腹腔糖耐量功能變化曲線

Fig.5 The variation curve of glucose tolerance function in abdominal cavity in two groups of rats on the 16th day after transplantation

2.7 組織形態(tài)學(xué)觀察

切取標(biāo)本HE染色發(fā)現(xiàn)，光鏡下腸系膜部可見(jiàn)數(shù)個(gè)深染、聚集成團(tuán)的胰島嵌入，周圍伴生細(xì)小血管(圖7A)；腎臟移植部切片可見(jiàn)正常腎小球、小管形態(tài)，被膜下存在胞漿紅色、核小深染的胰島聚集(圖7B).

圖6 兩組移植胰島Kaplan-Meier生存曲線

A:光鏡下腸系膜部HE染色形態(tài)，箭頭所示為移植后嵌入其中的存活胰島；B:腎被膜部HE染色形態(tài)，箭頭處為移植后聚集成團(tuán)的胰島.

A:HE staining of mesenteric mesentery under light microscope. The arrow shows viable islets embedded in the mesenteric mesentery after transplantation. B: HE staining of renal capsule. At the arrow were clustered islets after transplantation.

圖7 兩組大鼠移植部位組織標(biāo)本HE染色(×20)

Fig.7 HE staining of transplanted tissue in two groups of rats(×20)

3 討論

T1DM又稱胰島素依賴型糖尿病，內(nèi)源性胰島素分泌絕對(duì)不足和早期并發(fā)酮癥酸中毒是T1DM的主要特征，患者需要終生應(yīng)用外源性胰島素模擬正常生理分泌進(jìn)行血糖調(diào)控.調(diào)節(jié)過(guò)程中出現(xiàn)的難以控制的血糖波動(dòng)一直困擾著臨床醫(yī)生和患者.因此，胰島移植作為一種可穩(wěn)定血糖、緩解低血糖發(fā)作和改善并發(fā)癥的方式，對(duì)于T1DM的治療具有重要意義[15].在影響移植成功的因素中，胰島定植部位的選擇尤為重要.目前經(jīng)門靜脈或腎臟進(jìn)行胰島移植的應(yīng)用最為廣泛，但門靜脈高壓出血和血栓、經(jīng)血液介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)(instant blood mediated inflammatory reaction,IBMIR)以及急性排斥反應(yīng)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)也不容忽視[16].理想的胰島定植部位應(yīng)包含豐富的氧氣和滋養(yǎng)血流，存在免疫特權(quán)使移植物損失最小化并且允許以最小的侵入性方法完成移植.

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)腸系膜部進(jìn)行移植胰島能夠降低糖尿病大鼠高血糖狀態(tài)，有效恢復(fù)正常血糖水平；對(duì)于高糖刺激能促進(jìn)機(jī)體C肽分泌.血清中的C肽與胰島素均是胰島β細(xì)胞的分泌產(chǎn)物，半衰期較胰島素長(zhǎng)且不受肝臟酶滅活，此實(shí)驗(yàn)表明移植后的胰島分泌功能良好[17].有研究指出，腹腔系膜及網(wǎng)膜組織是有益于胰島定植的部位.解剖學(xué)上，腸系膜為腹后壁與空腸、回腸之間的雙層腹膜，內(nèi)含血管、神經(jīng)和淋巴結(jié)，是一個(gè)高度血管化的部位.血管化的程度決定是否可以提供充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)[18]；其次，腸系膜組織與胰腺具有相同的胚胎源性，此處血供經(jīng)門靜脈引流可模擬胰島的天然內(nèi)分泌途徑[19]；再次，腸系膜部還可分泌多種生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、CXC趨化因子等促進(jìn)移植胰島的存活[20-21].

Espes等[22]將胰島定量移植到網(wǎng)膜內(nèi)和門靜脈進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境更有利于移植物再血管化和再神經(jīng)化過(guò)程，在血糖調(diào)控方面更符合生理途徑；Berman等[23]通過(guò)血漿和人血凝酶在糖尿病大鼠網(wǎng)膜內(nèi)構(gòu)建“生物支架”，移植大量胰島后2 d即扭轉(zhuǎn)高血糖狀態(tài)，并維持正常血糖超過(guò)150 d，取得了良好的移植效果.本研究中經(jīng)腸系膜部移植后，大鼠腹腔糖耐量功能與腎被膜下移植相比均表現(xiàn)良好.糖刺激實(shí)驗(yàn)顯示移植早期，兩移植部位的分泌功能無(wú)明顯不同；但移植后期表明，腸系膜移植部位分泌功能優(yōu)于腎被膜下移植.不僅如此，通過(guò)對(duì)血糖連續(xù)監(jiān)測(cè)證實(shí)，移植初期腎被膜下組降糖速度較腸系膜部稍快，但腸系膜部移植胰島的平均生存時(shí)間較腎被膜下長(zhǎng).Stokes等[8,24]在豬同種異體移植和鼠科移植模型中提出，胰島定植于腎臟因早期血運(yùn)豐富引發(fā)降糖作用迅速，但腎被膜下腔的彈性與致密程度導(dǎo)致難以進(jìn)行大量移植，導(dǎo)致降糖能力持續(xù)時(shí)間較短.

另外，在操作過(guò)程中腸系膜部容受性較好，可擺脫移植數(shù)量的限制，允許植入較多數(shù)量的胰島；同時(shí)規(guī)避了出血、門靜脈血栓及免疫反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn).同樣Baidal等[25]提出，將胰島和T1DM患者的血漿蛋白共同移植到系膜組織內(nèi)并取得了良好的療效，在術(shù)后12個(gè)月里，胰島素的用量明顯減少且未發(fā)生嚴(yán)重的低血糖事件.

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)腸系膜移植的胰島能順利存活并安全、有效地降低糖尿病大鼠的血糖濃度，療效優(yōu)于腎被膜下移植，可為胰島移植治療T1DM提供了一個(gè)新的替代部位，為將來(lái)在臨床中應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).