欒磊磊， 楊宇峰， 王慶， 高良敏

(1.安徽理工大學(xué) 能源與安全學(xué)院， 安徽 淮南 232000；2.暨南大學(xué) 水生生物研究所∥水體富營養(yǎng)化與赤潮防治廣東省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510632)

休眠是海洋浮游動(dòng)物度過不良環(huán)境的重要生存策略[1-2]，水體中的現(xiàn)生種群和沉積物中的休眠種群組成了浮游動(dòng)物種群.在水生態(tài)系統(tǒng)中，當(dāng)食物短缺、鹽度或季節(jié)變化等不利因素出現(xiàn)時(shí)，物種的種類和種群密度會(huì)發(fā)生變化，當(dāng)生存環(huán)境好轉(zhuǎn)時(shí)，又恢復(fù)到原來的水平，這是因?yàn)槌练e物中存在浮游動(dòng)物的“卵池”[3-4].河口浮游動(dòng)物為適應(yīng)獨(dú)特的環(huán)境，以產(chǎn)休眠卵或遷移等方式度過不良環(huán)境[5-6]，休眠卵在沉積物中累積形成卵池或卵庫，卵庫對水體中浮游種群結(jié)構(gòu)、演替和維持種群穩(wěn)定具有重要意義[7-9].

關(guān)于休眠卵分布的研究主要集中在北溫帶，亞熱帶的報(bào)道較少[2,10].珠江口是我國重要的亞熱帶河口，桂山島位于珠江口咸淡水交匯區(qū)，環(huán)境波動(dòng)較大.選取桂山島海域作為研究區(qū)域，以探討沉積物中休眠卵萌發(fā)受環(huán)境因子的影響，研究結(jié)果為亞熱帶河口浮游動(dòng)物的潛在補(bǔ)充機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對揭示亞熱帶河口浮游動(dòng)物群落演替規(guī)律具有重要參考價(jià)值.

1 材料與方法

1.1 樣品的采集及質(zhì)量控制

用彼得遜采泥器采集0～5 cm表層沉積物于 4 ℃冰箱中冷藏，用于休眠卵萌發(fā)實(shí)驗(yàn)；水溫、鹽度和pH等用美國YSI plus多參數(shù)水質(zhì)分析儀現(xiàn)場測定；水體浮游動(dòng)物采集使用40 μm的浮游生物網(wǎng)由底層至表層垂直拖網(wǎng)，并加甲醛固定，最終含甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%.

1.2 實(shí)驗(yàn)組設(shè)置

實(shí)驗(yàn)使用CuCl2、ZnCl2、CdCl2、NaCl、HCl、NaOH優(yōu)級(jí)純試劑，用去離子水配成母液后備用.實(shí)驗(yàn)對重金屬和生源要素進(jìn)行前處理及質(zhì)量控制，方法同Gu等[11-12]一致，同步采用GBW07437國家標(biāo)準(zhǔn)對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)的回收率實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用于校正分析結(jié)果，樣品中重金屬和總磷(TP)均采用美國Optima 2100DV光譜儀測定，通過對結(jié)果的綜合，沉積物中TP的回收率介于92%～97%，Cu、Zn和Cd的回收率介于89%～102%.取40 g沉積物置于燒杯中，根據(jù)采樣點(diǎn)沉積物背景值的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(測定沉積物中Cu、Zn、Cd的背景值分別為29.46、105.20、0.18 mg/kg[13])和沉積物的含水率(57.42%)，采用Jiang等[14]方法，計(jì)算出樣品去除含水率后的質(zhì)量和Cu、Zn、Cd的含量，并結(jié)合樣品去除含水率后的體積，據(jù)此調(diào)節(jié)CuCl2、ZnCl2、CdCl2的濃度.

將Cu、Zn、Cd重金屬濃度調(diào)為背景值的2、4、8、16、32倍，將不同濃度的重金屬對沉積物休眠卵分別處理48、72和92 h；取250 g沉積物置于燒杯中，用單因子變量法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別將溫度調(diào)為15、20、25、30、35 ℃，鹽度調(diào)為0、10、15、20、25、30、35、40、50，pH調(diào)為6、7、8、9、10，沉積物中休眠卵分別冷藏半個(gè)月和10個(gè)月后進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)用海水均采用 0.45 μm 濾膜進(jìn)行過濾，以排除海水中浮游動(dòng)物的干擾，每組設(shè)3個(gè)平行，并設(shè)置對照組，將沉積物中休眠卵置于GXZ 300c型智能照明培養(yǎng)箱，溫度(25±1)℃，鹽度30，光照L ∶D=12 ∶12) 中培養(yǎng)萌發(fā).

此外還在原位海區(qū)不同水深進(jìn)行休眠卵的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，將沉積物置于透明瓶中，加入原位海水(0.45 μm 濾膜過濾)，用雙層篩絹網(wǎng)將口封住，分別置于離海面深度0.5、1、2 m，每個(gè)深度3個(gè)重復(fù)試驗(yàn).

1.3 樣品萌發(fā)與計(jì)數(shù)

將樣品用20 μm 篩絹網(wǎng)過濾，并將截留樣品置于奧林巴斯體視顯微鏡SZX7下鏡檢萌發(fā)的幼體并計(jì)數(shù)；更換0.45 μm 濾膜過濾后的新鮮海水于實(shí)驗(yàn)組中繼續(xù)萌發(fā)，若連續(xù)8 d 以上沒有觀察到幼體孵化時(shí)，即判定沉積物中存活休眠卵已全部孵化.

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用 SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 8.5進(jìn)行繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 調(diào)查海域基本情況

調(diào)查海域水溫29.4 ℃，鹽度22.68，pH 8.37，溶解氧5.59 mg/L；沉積物中TP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為403.96 mg/kg，Cu、Zn、Cd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為29.46、105.20、0.18 mg/kg[13].采樣期間水體中共發(fā)現(xiàn)小擬哲水蚤、刺尾紡錘水蚤、錐形寬水蚤、太平洋紡錘水蚤、亞強(qiáng)次真哲水蚤、微刺哲水蚤、左指華哲水蚤7種，其中已報(bào)道產(chǎn)休眠卵的種類有刺尾紡錘水蚤、太平洋紡錘水蚤、左指華哲水蚤[15].

2.2 重金屬處理對休眠卵萌發(fā)的影響

Cu處理48 h組和72 h組增加到背景值的16倍，96h組增加到背景值2倍，沉積物中休眠卵死亡率達(dá)到100%；Zn處理48 h組增加到背景值的32倍，72 h組增加到背景值的16倍，96 h組增加到背景值的8倍，沉積物中休眠卵死亡率達(dá)到100%；Cd處理48、72、96 h組增加到背景值的32倍，沉積物中休眠卵死亡率都未達(dá)到100%；混合處理48 h組增加到背景值的16倍，72 h組增加到背景值8倍，96 h組增加到背景值的2倍，沉積物中休眠卵死亡率達(dá)到100%.因此，增加濃度、增加處理時(shí)間休眠卵孵化的幼體數(shù)量明顯減少，休眠卵死亡率呈明顯上升趨勢(圖1).

A：銅處理休眠卵的孵化量；B：鋅處理休眠卵的孵化量；C：鎘處理休眠卵的孵化量；D：銅、鋅、鎘混合處理休眠卵的孵化量

A:Amount of incubation of resting eggs treated with copper; B:Amount of incubation of resting eggs treated with zinc; C:Amount of incubation of resting eggs treated with cadmium; D:Incubation amount of resting eggs treated with copper, zinc and cadmium

圖1 不同重金屬處理休眠卵的孵化量

Fig.1 Amount of incubation of resting eggs treated with different heavy metals

2.3 水溫對休眠卵萌發(fā)的影響

實(shí)驗(yàn)水溫分別調(diào)為15、20、25、30、35 ℃，研究水溫對沉積物中休眠卵萌發(fā)的影響.結(jié)果表明在15 ℃～25 ℃區(qū)間，隨著水溫升高休眠卵孵化數(shù)量增多，水溫超過25 ℃孵化數(shù)量減少.沉積物中休眠卵萌發(fā)的最適水溫是25 ℃，此溫度下萌發(fā)的數(shù)量最多(78個(gè))，水溫達(dá)到35 ℃時(shí)僅萌發(fā)2個(gè)(圖2)，不同水溫對休眠卵萌發(fā)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).

圖2 不同水溫休眠卵的孵化量

Fig.2 Amount of incubation of resting eggs in different water temperature

2.4 鹽度對休眠卵萌發(fā)的影響

實(shí)驗(yàn)鹽度分別調(diào)為0、10、15、20、25、30、35、40、50，研究鹽度對沉積物中休眠卵萌發(fā)的影響，在鹽度為0～30區(qū)間隨著鹽度增加，休眠卵萌發(fā)的數(shù)量增多，鹽度超過30萌發(fā)數(shù)量減少，萌發(fā)的最適鹽度為30，此鹽度下萌發(fā)的數(shù)量最多(82個(gè))，鹽度過高或過低都不利于休眠卵萌發(fā)(圖3)，不同鹽度對休眠卵萌發(fā)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).

圖3 不同鹽度休眠卵的孵化量

Fig.3 Amount of incubation of resting eggs in different salinity

2.5 pH對休眠卵萌發(fā)的影響

實(shí)驗(yàn)pH分別調(diào)為6、7、8、9、10，研究pH對沉積物中休眠卵萌發(fā)的影響，結(jié)果表明pH在6～8區(qū)間隨著pH增加，休眠卵萌發(fā)的數(shù)量增多，pH 為8是萌發(fā)的最適 pH，在此條件下休眠卵萌發(fā)的數(shù)量最多(83個(gè))，海水pH過高(pH<8)或過低(pH>8)都不利于休眠卵萌發(fā)(圖4)，pH不同的海水對休眠卵萌發(fā)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).

圖4 不同pH休眠卵的孵化量

Fig.4 Amount of incubation of resting eggs under different pH

2.6 低溫冷藏對沉積物休眠卵萌發(fā)的影響

于8月、9月和10月3次采集沉積物樣品，將沉積物分別冷藏半個(gè)月和10個(gè)月后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)橈足類休眠卵冷藏10個(gè)月后潛在補(bǔ)充量(8月為8.4×105ind./m3,9月為6×105ind./m3，10月為5.3×105ind./m3)顯著高于冷藏半個(gè)月(8月為0.18×105ind./m3,9月為0.47×105ind./m3，10月為0.56×105ind./m3)，輪蟲休眠卵冷藏半個(gè)月后休眠卵潛在補(bǔ)充量(8月為0.007×105ind./m3,9月為0 ind./m3，10月為0.027×105ind./m3)明顯少于橈足類，而冷藏10個(gè)月后輪蟲休眠卵潛在補(bǔ)充量為0(圖5)，表明橈足類和輪蟲休眠卵對冷藏刺激的響應(yīng)不一.

2.7 原位海區(qū)不同水深對休眠卵萌發(fā)的影響

休眠卵放置在采樣海域進(jìn)行孵化，結(jié)果顯示：放置在離海面0.5 m處休眠卵潛在補(bǔ)充量(4.44×104ind./m3)顯著高于2 m處(1.22×104ind./m3).沉積物中休眠卵的孵化過程大致呈鋸齒狀分布，第3天潛在補(bǔ)充量最多(0.5、1和2 m處分別為：0.089×104、0.056×104、0.022×104ind./m3)，孵化持續(xù)50天左右，不同水深之間孵化持續(xù)時(shí)間無明顯差異(圖6).

A:不同冷藏時(shí)間橈足類休眠卵的潛在補(bǔ)充量；B:不同冷藏時(shí)間輪蟲休眠卵的潛在補(bǔ)充量

A:0.5 m處休眠卵的潛在補(bǔ)充量；B：1 m處休眠卵的潛在補(bǔ)充量；C：2 m處休眠卵的潛在補(bǔ)充量

A：Potential supplement of resting eggs at 0.5 meter water depth; B:Potential supplement of resting eggs at 1 meter water depth; C:Potential supplement of resting eggs at 2 meter water depth

圖6 原位海區(qū)不同水深休眠卵的潛在補(bǔ)充量

Fig.6 Potential supplement of resting eggs under different depths of situ sea area

3 討論

3.1 沉積物中休眠卵對重金屬的響應(yīng)

桂山島沉積物中Cu潛在生態(tài)危害較重，屬于嚴(yán)重污染，Zn潛在生態(tài)危害較輕，屬于中污染、Cd潛在生態(tài)危害較輕，屬于低污染[13].本研究選取Cu、Zn、Cd 3種重金屬對沉積物中休眠卵的毒性影響，結(jié)果顯示毒性效應(yīng)由大到小依次為Cd>Cu> Zn.沉積物中休眠卵對Cd非常敏感，在暴露2倍于Cd背景值即可使其死亡率達(dá)到50%.

Natalia等[16]研究發(fā)現(xiàn)Cu、Cd、Zn對多刺裸腹蚤(Moinamacrocopa)休眠卵的半致死濃度(LC50)(24 h)分別為(0.009 4±0.000 2)、(0.284±0.029)，(1.19±0.18)mg/L，LC50 (48 h)分別為(0.009 4±0.000 2)、(0.169±0.020)、(0.34±0.02)mg/L，對Cd、Zn較敏感；Nandini等[17]研究發(fā)現(xiàn)Cu、Zn對Moinamacrocopa休眠卵的LC50 (24 h)分別為0.71、1.01 mg/L，徐善良等[18]研究發(fā)現(xiàn)Cd對Moinamacrocopa休眠卵的LC50 (48 h)為0.053 mg/L，結(jié)果表明同一物種休眠卵在不同區(qū)域，環(huán)境不同，對重金屬的耐受性表現(xiàn)不一致，半致死濃度的差異較大.

廈門灣沉積物中Cu、Cd兩種重金屬對太平洋紡錘水蚤(Acartiapacifica)休眠卵的孵化影響結(jié)果表明，Cu質(zhì)量分?jǐn)?shù)從34.8 mg/kg增加到348 mg/kg，休眠卵孵化量減少46.6%～100%，Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.68 mg/kg增加到6.8 mg/kg，休眠卵孵化量減少31.6%～94.7%[14]，實(shí)驗(yàn)重金屬濃度和死亡率均高于桂山島，可能因?yàn)椴蓸訁^(qū)域不同，采樣點(diǎn)的污染程度不同，沉積物中休眠卵對重金屬的耐受性不一樣，且試驗(yàn)物種也不一樣，對休眠卵孵化影響差異較大.

此外，重金屬對對河口底棲橈足類(Amphiascustenuiremis)成體的毒性影響由大到小依次為Cd>Cu>Ni>Zn>Pb[19]，與本研究對休眠卵的毒性影響結(jié)果一致，重金屬對底棲浮游動(dòng)物及其休眠卵均有影響.

3.2 沉積物中休眠卵對水溫、鹽度、pH的響應(yīng)

水溫、光照及 pH 等環(huán)境因素對沉積物中休眠卵具有重要影響[2,10,20-22].不同種類浮游動(dòng)物適應(yīng)不同的水溫、鹽度和pH等條件，研究發(fā)現(xiàn)，日本海一種浮游動(dòng)物Tortanusforcipatus休眠卵可在13 ℃～30 ℃溫度范圍孵化，25 ℃孵化率最高，在鹽度為18～54時(shí)均有幼體孵化[23]；波羅的海的一種紡錘水蚤(Acartiatonsa)休眠卵在溫度為5 ℃～23 ℃，鹽度為 0～34水體中都可以成功孵化，水溫23 ℃時(shí)孵化率最高為92.2%，鹽度在17～25之間時(shí)孵化率最高為81.4%～84.5%[24].

本研究中，沉積物中的休眠卵能在水溫為15 ℃～35 ℃，鹽度為0～50，pH 為6～10的條件下萌發(fā)，表明沉積物中有適應(yīng)不同水溫、鹽度和pH種類的休眠卵，能在相應(yīng)條件下孵化以補(bǔ)充水體中的浮游動(dòng)物種群，從而在變化的環(huán)境中維持種群的延續(xù).有研究表明，浮游動(dòng)物群落在鹽度變化的刺激后，其恢復(fù)是由于現(xiàn)存卵庫的作用[25-26].

3.3 沉積物中休眠卵對低溫冷藏的響應(yīng)

休眠卵必須度過內(nèi)滯育期才能孵化，低溫刺激有助于縮短其內(nèi)滯育期并保持可育性，因此低溫冷藏對休眠卵萌發(fā)具有重要影響[22,27-28].Glippa等[5]在研究休眠卵孵化時(shí)，發(fā)現(xiàn)冷藏11個(gè)月后(孵化率4.5%) 比立即進(jìn)行孵化(孵化率0.7%)孵化率明顯提高，廈門灣中心區(qū)域Acartiapacifica休眠卵在10 ℃儲(chǔ)存3～60 d用于研究碳?xì)浠镂廴緦Τ练e物休眠卵的影響[29]，Kasahara等[30]發(fā)現(xiàn)5 ℃將休眠卵冷藏14～15個(gè)月孵化率明顯低于冷藏1～2個(gè)月，Vandekerkhove等[31]將休眠卵在黑暗環(huán)境下4 ℃冷藏7個(gè)月后進(jìn)行休眠卵分離孵化實(shí)驗(yàn).

本研究結(jié)果表明橈足類和輪蟲休眠卵在4 ℃冷藏半個(gè)月和10個(gè)月，孵化量差異顯著，橈足類休眠卵和輪蟲休眠卵對低溫刺激的響應(yīng)不同，可能是因?yàn)闃镒泐愋菝呗巡粦?yīng)期較長，需經(jīng)過較長時(shí)間的低溫刺激，而輪蟲休眠卵內(nèi)滯育期較短或已渡過內(nèi)滯育期.研究發(fā)現(xiàn)橈足類哲水蚤(Acartiabilobata)在4 ℃冷藏14天孵化率最高，冷藏1年后孵化率下降[32].不同海域沉積物中休眠卵的種類不同，環(huán)境不同，導(dǎo)致其內(nèi)滯育期不同，對低溫刺激的響應(yīng)不同，需要低溫刺激的時(shí)間不同.

3.4 休眠卵萌發(fā)對原位環(huán)境的響應(yīng)

本研究的原位萌發(fā)是直接將沉積物置于原位海區(qū)中，利用自然海區(qū)的水溫、光照、海水?dāng)噭?dòng)等，模擬休眠卵在采樣區(qū)域水體中的萌發(fā).測得深度為0.5、1、2 m處白天的光照強(qiáng)度分別為193～266、108～230、47～70 μmol·m-2·s-1,離海平面越遠(yuǎn)光照強(qiáng)度越弱，休眠卵孵化量也越少，休眠卵在不同水深孵化數(shù)量與光照呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，2 m深度處休眠卵孵化數(shù)量只有0.5 m深度處的1/4.

4 結(jié)論

Cu、Zn和Cd均對沉積物中休眠卵有較大影響，可導(dǎo)致沉積物中休眠卵死亡率增加，Cd對休眠卵的毒性效應(yīng)最大，且隨著三種重金屬濃度的增加和處理時(shí)間的延長，休眠卵死亡率呈明顯上升趨勢；休眠卵能在較寬的水溫、鹽度和pH范圍萌發(fā)，且隨著水溫、鹽度和pH的增加孵化數(shù)量呈上升趨勢，到達(dá)最適值后呈下降趨勢，不同水溫、鹽度和pH對休眠卵萌發(fā)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，桂山島海域沉積物中休眠卵最適孵化條件為：水溫 25℃、鹽度 30、pH 8；冷藏刺激有利于沉積物中橈足類休眠卵的萌發(fā)，橈足類休眠卵冷藏10個(gè)月后萌發(fā)量顯著高于冷藏半個(gè)月；放置在采樣海域進(jìn)行孵化，休眠卵的孵化數(shù)量受光照影響較大，隨著光照強(qiáng)度減弱，孵化數(shù)量顯著減少，孵化數(shù)量與光照強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)(P<0.01).